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特别说明：本文由波函数信息科技有限公司（波函数计算）原创撰写，旨在分享相关科研知识。因学识有限，难免有所疏漏和错误，请读者批判性阅读，也恳请大方之家批评指正。编辑丨波函数研究背景 蛋白质表面的小分子结合口袋是药物发现的核心切入点。围绕这一任务，现有方法大致分为三条主线：一是基于同源比对的位点迁移，代表工具如 GRaSP、3DLigandSite、AlphaFill 等，依靠已知配体–蛋白共晶结构，把结合位点标注传递给序列或结构相似的目标蛋白；二是基于几何探针的口袋搜索，代表工具如 fpocket、P2Rank，通过 alpha 球或溶剂可及探针点识别蛋白表面凹陷区域，其中 P2Rank 以随机森林分类器对表面探针点作口袋概率打分，是被广泛引用的基线；三是端到端深度学习模型，如 VN-EGNN、GrASP，利用图神经网络与虚节点直接从蛋白结构训练位点分类器。这些路线共同支撑起过去十年的口袋预测能力，但当目标蛋白缺乏同源共晶模板、口袋隐藏在柔性区域或大幅构象重排之后、或整个蛋白家族在训练集之外时，仍难以给出可靠的 de novo 预测。与此同时，AlphaFold2 类结构预测模型在训练中显然掌握了远多于坐标本身的进化与几何先验，但如何把这些先验直接转化为结合位点信号，此前并无系统答案。关键问题 目前，蛋白 – 小分子结合口袋预测主要存在以下问题：1、去模板化的 de novo 结合位点预测缺乏可迁移的高质量特征表示 同源迁移方法必须依赖已解晶体和高相似度模板，孤儿蛋白与全新靶点束手无策；几何探针法只看表面凹陷，忽略序列演化与化学环境；端到端深度学习模型受限于蛋白 – 配体共晶数据总量（不足万级），在训练集之外的蛋白类别上易过拟合、泛化能力弱。仅凭实验共晶数据无法直接推断"未见蛋白上口袋在哪"，需要另一套可迁移的、能被神经网络自然掌握的先验表示。2、现有方法难以支撑蛋白组尺度的批量口袋筛查 传统流程逐蛋白解晶体、逐蛋白同源比对，成本高、覆盖窄；同源迁移会漏掉大量"孤儿口袋"，尤其是变构位点、疾病相关新靶点、以及尚无配体结构报道的 apo 蛋白。要把口袋预测能力扩展到整个人类蛋白组，需要一条既快又稳、还能对训练外蛋白家族保持鲁棒的批量筛查路线。新思路 有鉴于此，Dana-Farber Cancer Institute 与哈佛医学院的 Nicholas F. Polizzi 与 MIT、EPFL 的 Sergey Ovchinnikov 等报道了 AF2BIND（AF2 bait-informed neural descriptor）方法，将 20 种正则氨基酸以大残基索引偏移（offset 50）分别单独挂在目标蛋白序列末尾作为 bait 残基，对 AlphaFold2 做一次前向计算获取其 pair 表示，再用逻辑回归模型将每个目标残基与 20 个 bait 的 pair 特征映射为 P(bind) 概率。方法基于约 2000 个非冗余蛋白 – 小分子共晶结构训练，在 67 蛋白测试集上取得 binding-residue recovery 66.2%、ROC AUC 0.936；扫遍 13686 个人蛋白后共预测 20302 个口袋，其中 15755 个在 AlphaFill 中无任何配体证据。该方法为孤儿蛋白与全蛋白组尺度的口袋筛查提供了新的可迁移表示。技术方案1、发现 AF2 pair 表示中蕴含 de novo 结合位点信号 在目标蛋白序列后追加 20 个 bait 氨基酸并做单次 AlphaFold2 前向计算，即可从 pair 表示中提取每个目标残基与 20 个 bait 的配对活性，构成 20 × 128 的 pair 特征切片。2、以逻辑回归解析 bait 激活模式 对 pair 特征做逻辑回归得到 P(bind)，模型可解释性允许直接分解各 bait 对 sigmoid 激活的独立贡献，Spearman 分析显示疏水 bait 集中激活疏水口袋。3、以 recovery 与 ROC AUC 定量比较多种表征 在 67 蛋白测试集上，AF2-pair 单独取得 recovery 0.662、ROC AUC 0.936，显著优于 AF2-single（0.454、0.840）、ESM2（0.523、0.872）与 ESM1-IF（0.637、0.928）。4、以人类蛋白组扫库验证普适性与新颖性 对 pLDDT 修剪后的 AF2 人蛋白组结构做批量预测，阈值 P(bind) > 0.28，密度聚类得到 20302 个口袋，其中 15755 个位点未被 AlphaFill 覆盖，9732 个位点未被 P2Rank 命中，涵盖大量 Morbid Map 疾病相关蛋白。技术优势1、开创了不依赖 MSA、同源模板与已知配体的 de novo 位点预测 AF2BIND 完全跳过多序列比对、结构模板对齐与配体信息输入，仅需目标蛋白序列与主链坐标，即可在 pair 表示与逻辑回归的组合中直接输出每个残基的结合概率。这一路线摆脱了同源比对对模板质量的严苛要求，对孤儿蛋白、无配体共晶的全新靶点、以及仅有 AlphaFold 预测结构的 apo 蛋白同样适用。μ-阿片受体、腺苷酸激酶、麦芽糖结合蛋白、钙调蛋白等大幅度构象重排蛋白的多构象验证显示，backbone RMSD 达 0.7 Å 时残基 P(bind) 的标准差仅 0.02，模型对结构变化保持稳态。2、大幅提升了全蛋白组尺度批量口袋筛查的覆盖度 AF2BIND 在训练中显式扣除 G 蛋白偶联受体（GPCR）与 bromodomain 等家族，仍能在 μ-阿片受体（PDB 8EF5）与 BRD4 第二个 bromodomain（PDB 7RUH）等 held-out 蛋白上恢复主口袋，展示了对未见家族的迁移能力。在 39 个 apo 状态 AF2 预测的变构蛋白结构上，AF2BIND 恢复了三分之二的变构位点，对 allosteric 数据集 ROC AUC 达 0.91。全蛋白组扫描输出 20302 个位点、覆盖 13686 个蛋白，其中 15755 个位点在 AlphaFill 中无同源配体证据，为疾病相关孤儿口袋提供了首个可查询数据库。在 PARP14 macrodomain 2 上，即便变构位点在 AF2 预测结构中被一个额外的 loop 遮挡且相对晶体结构 Cα RMSD 约 1.9 Å，AF2BIND 仍能正确定位到该 allosteric 口袋。技术细节1、AF2BIND 架构与 bait 氨基酸设计 作者以目标蛋白序列 + 主链模板为 AF2 输入，将 20 种正则氨基酸以残基索引偏移 50 依次单独附加到序列尾部作为 bait 残基，未提供 bait 的模板结构。在 AF2 一次前向计算中获得 pair 表示后，只保留每个目标残基与 20 个 bait 位置之间双向的 pair 特征切片，拼接维度为 20 × 2 × 128 = 5120 维。将测试集共 21322 个残基的 5120 维特征送入逻辑回归模型，输出每个目标残基是否为小分子结合残基的 P(bind)。模型训练 320 epochs、batch size 12、ADAM 优化器、学习率 1×10⁻⁴、L2 正则化权重 0.03，训练集依据 TM score > 0.5 加权抑制冗余。 图 | 原文 Figure 1 + Figure 2｜AF2BIND 输入输出流程与 bait 激活图的可解释性拆解2、多种蛋白表征的对照评估 作者在同一 67 蛋白测试集上比较了 AF2-single、ESM2、ESM1-IF、AF2-pair 及组合方案的 binding-residue recovery 与 ROC AUC。AF2-single 表征仅取得 recovery 0.454、ROC AUC 0.840；仅编码序列的 ESM2 为 0.523、0.872；仅编码结构的 ESM1-IF 达 0.637、0.928；AF2-pair 单独已升至 0.662、0.936；AF2-pair 与 ESM1-IF 拼接组合达 0.689、0.945；三种表征全部组合仅微增至 0.690、0.945。结果表明 AF2 内部的 pair 表示已经捕捉到远超 single 表征的结合位点先验，是 AF2BIND 性能领先的关键。 图 | 原文 Figure 3 + Extended Data Figure 4｜多种表征的 recovery 与 ROC AUC 对照3、训练外蛋白家族与柔性构象的鲁棒性验证 作者对 GPCR、bromodomain 等家族基于序列与结构相似度整族扣除后重新训练。以 fentanyl 结合的人 μ-阿片受体（PDB 8EF5）与 BRD4 第二个 bromodomain（PDB 7RUH）为例，AF2BIND 均可精准定位主口袋。对同一 μ-阿片受体的 4 个 backbone RMSD 平均 0.7 Å 的构象做重复预测，残基 P(bind) 标准差仅 0.02，模型对结构扰动近乎不敏感。对腺苷酸激酶、麦芽糖结合蛋白、钙调蛋白等 open-close 大幅构象重排蛋白，AF2BIND 在 bound 与 unbound 结构上均维持高 recovery。 图 | 原文 Figure 4 + Extended Data Figure 9｜held-out 家族与柔性构象的 P(bind) 空间分布4、人类蛋白组扫描与新口袋数据库构建 作者在 pLDDT 修剪并按 ECOD 域切分后的 AF2 人蛋白组结构上批量运行 AF2BIND，取每残基跨切片的最大 P(bind)，并对溶剂可及表面积（SASA） < 0.03 的埋藏残基置零，随后按空间邻近做密度聚类得到多残基口袋。全蛋白组共输出 20302 个口袋，覆盖 13686 个蛋白；其中 15755 个位点与 AlphaFill 已迁移配体无任何残基重叠，9732 个位点与 P2Rank 预测无重叠、且 4900 余个蛋白 P2Rank 完全未预测出任何口袋。AF2BIND 与 P2Rank 合并后共给出约 29000 个非冗余口袋、覆盖 15026 个蛋白，其中大量位点分布在 Morbid Map 疾病相关蛋白上。作者进一步以 SiteMap Dscore 评估合并库中每个口袋的成药性，AF2BIND 的 bait 激活模式与 Dscore 的 Spearman 相关达 0.40，高于 P2Rank probability 与 Dscore 的 0.31；训练集中 947 个小分子有 640 个（约 68%）满足 Lipinski rule of 5，AF2BIND 的 P(bind) 因此天然偏向成药口袋。在 39 个仅由 AF2 预测的 ligand-free 变构蛋白结构上，AF2BIND 恢复了三分之二的变构位点，与化学蛋白组学交叉比对亦成功命中 78 条包含反应性 Cys 的 tryptic peptides。 图 | 原文 Figure 5 + Figure 6｜bait 激活模式与人蛋白组新口袋覆盖统计展望 该研究基于 AF2 pair 表示与逻辑回归构建了 AF2BIND，摆脱了同源模板、多序列比对与已知配体三重限制，将 de novo 小分子结合口袋预测扩展到全蛋白组尺度，并在 GPCR、bromodomain、变构位点等训练外场景上保持鲁棒。若下游辅以 QM/MM 与分子动力学（MD）联用，对 AF2BIND 命中的口袋做过渡态搜索、反应坐标能量扫描、结合自由能计算与氢键网络演化分析，可为疾病相关孤儿口袋的成药性评估、变构口袋的开合动力学刻画、与 Boltz-1、AlphaFold 3、RoseTTAFold All-Atom 等下一代共折叠模型的融合筛选，提供可定量、可证伪的物理化学证据链；同时也为把 20 个氨基酸 bait 替换为覆盖更广化学空间的探针片段以构建下一代结合口袋预测器留出接口。本研究本身未使用量子化学计算方法，属于结构预测与机器学习方向的方法论工作。关于波函数 波函数信息科技有限公司（Bohanshu Tech）专注于量子化学计算即服务，为高校课题组、科研院所与工业研发团队提供从模型构建、方法选型到高精度计算的一站式理论支持。 在本篇报道所涉及的 AF2 pair 表示位点预测与蛋白组级口袋筛查基础之上，进一步的 QM/MM 分层能量扫描、结合自由能 MD 采样、过渡态搜索、氢键网络与静电环境动力学分析，以及基于机器学习势的中长时程反应轨迹追踪，是我们日常为生物医药、酶催化与新药研发方向合作团队提供的核心服务。 合作模式：代算服务 · 联合科研 · 方法论咨询 · 软件培训 · 专项工作坊联系方式 电话 / 微信：18251485609（微信同号） 商务邮箱：tjd@bohanshukeji.com 参考文献：Gazizov, A., Lian, A., Goverde, C., Mou, J., Ovchinnikov, S. & Polizzi, N. F. AF2BIND: predicting small-molecule binding sites using the pair representation of AlphaFold2. Nat. Methods (2026).