Obecabatagene autoleucel

腺相关病毒 (AAV) 和慢病毒 (LV) 载体分别是体内和体外基因治疗的关键基因递送载体。这些疗法的广泛应用取决于开发可放大的生产工艺，以提高产量并同时降低成本。连续生物工艺通过最大限度地减少批次间停机时间、简化耗时耗力的步骤、整合串行操作以及减少因不稳定性造成的载体损失，为病毒载体生产提供了一种变革性的解决方案。本综述重点关注AAV和LV上游生物工艺的进展，特别是瞬时转染在连续生产中的适用性以及稳定细胞系开发的进展。此外，本文还探讨了旨在处理病毒载体体积大、稳定性有限的下游工艺 (DSP) 技术的发展。文中讨论了连续DSP的最新创新，包括单程切向流过滤和连续层析，以及用于连续澄清和核酸降低的新兴策略。由于强化工艺控制对于连续生物工艺至关重要，因此本文评估了当前工艺分析技术在监测方面的适用性。最后，探讨了向连续生物工艺过渡的技术经济影响。 简介 对病毒结构和机制的深入理解推动了多种基于病毒的基因递送系统的发展。这些病毒载体（VV）具有多种特性，包括稳定或瞬时基因表达能力、不同的包装容量、独特的组织趋向性以及独特的安全性。尽管各有特点，所有VV都具有三个核心组成部分：用于在靶细胞中表达的转基因盒、决定趋向性的衣壳或囊膜蛋白以及控制基因表达的调控元件。其中，慢病毒载体（LV）和腺相关病毒载体（AAV）是临床上最重要的VV，也是本文的重点。图1展示了影响工艺设计的重要LV和AAV特性。 图 1.腺相关病毒 (AAV) 和慢病毒 (LV) 载体的重要特征，这些特征可能会影响工艺设计，例如病毒大小、基因组类型、囊膜的存在、生产方式和稳定性。 慢病毒载体（LVs）能够高效转导分裂细胞和非分裂细胞，并通过转基因整合实现稳定的基因表达。利用异源囊膜糖蛋白进行假型化处理，可使其靶向多种细胞类型。LVs的主要应用是体外基因递送，即将患者来源的细胞进行修饰后再输注回体内。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种值得关注的基于LVs的治疗方法。在这些疗法中，LVs将CAR基因递送至患者自身的T细胞，然后将这些T细胞重新输注回体内，通过识别特定的肿瘤相关抗原来杀伤癌细胞。多种基于慢病毒载体（LV）的CAR-T疗法，例如Kyrmiah®、Breyanzi®和Aucatzyl，已获批用于治疗多种血液系统癌症。慢病毒载体还可用于对造血干细胞（HSC）进行基因修饰，通过递送功能基因来替换缺陷基因。已获批的基于慢病毒载体的HSC疗法包括用于治疗镰状细胞贫血的LentiGlobin和用于治疗异染性脑白质营养不良的Libmeldy。 腺相关病毒（AAV）主要用于体内基因递送，以实现来自游离型基因组的长期转基因表达。AAV衣壳工程技术的进步拓宽了其组织趋向性并提高了转导效率。AAV的主要应用是将载体直接注射到患者体内，以引入功能基因来补偿缺陷基因。基于AAV的疗法在治疗多种遗传性疾病方面已展现出显著的临床成功。已获批准的疗法包括用于治疗脊髓性肌萎缩症的Zolgensma®、用于治疗视网膜营养不良的Luxturna®、用于治疗杜氏肌营养不良症的Elevidys以及用于治疗A型血友病的Roctavian™（美国食品药品监督管理局（FDA），2024）。 尽管取得了这些成功，但基于慢病毒（LV）和腺相关病毒（AAV）的疗法的广泛应用仍受到高昂成本和有限产能的制约。连续生物工艺为应对这些挑战提供了一种解决方案。在单克隆抗体和重组蛋白的生产中，连续生产已被证明能够有效降低成本、提高生产率并缩小设施占地面积。对于病毒载体（VV）等不稳定产品，连续工艺还可以最大限度地缩短保存时间，减少产品暴露于不稳定环境的时间，从而防止感染性丧失。 国际人用药品注册技术协调会（ICH）于2022-2023年发布的Q13指南凸显了监管机构对连续生产的日益认可。该指南确立了清晰的审查路径，并表明监管机构愿意与业界合作，共同推进连续生产（欧洲药品管理局，2023）。这为实施符合监管预期的连续生产策略提供了一个切实可行的框架。 本综述探讨了将连续生物工艺应用于慢病毒（LV）和腺相关病毒（AAV）生产的机遇与挑战。首先评估了当前连续上游工艺的现状，包括瞬时转染的适用性以及稳定细胞系开发的进展。其次，对现有的贴壁和悬浮生物反应器以及灌流培养的细胞截留装置进行了评估。随后，讨论了连续下游工艺的进展和尚存的障碍，涵盖了连续层析、单程切向流过滤（SPTFF）和连续核酸消解，并将蛋白质生物制剂与病毒载体进行了类比。鉴于连续生物工艺中稳健的工艺控制至关重要，本文还探讨了适用于慢病毒和腺相关病毒生产的在线和入线过程分析技术（PAT）。最后，分析了采用连续生物工艺的技术经济意义。 连续上游工艺 选择合适的上游生产策略取决于多种因素，包括生产细胞系是瞬时表达还是稳定表达、培养方式是贴壁还是悬浮、补料/收获策略、生物反应器平台以及所需规模。载体的预期用途通常决定了这些生产条件。例如，对于用于临床研究的载体，高度可放大的生产方法至关重要。相反，对于转化研究，即使方法的可放大性有限，快速、高滴度的生产也可能是首要考虑因素。实施连续上游工艺需要选择能够长期维持生产的载体表达系统以及能够实现连续收获的培养容器。下文将详细阐述与这些选择相关的挑战和机遇。 瞬时转染和稳定生产细胞系 瞬时转染仍然是AAV和LV生产的主要方法，通常使用HEK293或HEK293T细胞，采用聚阳离子（例如PEI）或脂质体转染试剂以及编码载体基因组、包装功能和囊膜/衣壳蛋白的多质粒系统。该步骤的工艺开发涉及优化DNA与转染试剂的比例、转染时的细胞密度、DNA浓度和培养pH值。该方法的主要优势在于能够获得高滴度，研究表明LV的滴度可达~1 × 10⁷ TU mL⁻¹ 。此外，该方法还具有灵活性，可以轻松整合不同的转基因和衣壳或囊膜蛋白。对于慢病毒而言，它可以控制细胞毒性成分的表达，例如 VSV-G、蛋白酶和病毒蛋白 R。 然而，瞬时转染存在一些缺点，包括批次间差异以及质粒和转染试剂的高昂成本，这些因素通常使得该方法难以大规模生产。此外，该方法需要在下游工艺处理过程中去除工艺相关的杂质，例如残留的质粒DNA和转染试剂。PEI和脂质体转染试剂等试剂也可能对转染后的HEK293(T)细胞产生细胞毒性。这种细胞毒性可以通过手动或灌流方式更换转染培养基来减轻，从而实现病毒载体的连续收获。为了建立基于瞬时转染的连续生产工艺，可能需要重复或分批转染以延长生产窗口，该窗口通常仅限于转染后48-72小时。瞬时慢病毒 (LV) 的生产通常使用 HEK293 T 细胞，这些细胞表达 SV-40 大 T 抗原，已知该蛋白可抑制 p53 并阻止先天免疫反应的激活。对于腺相关病毒 (AAV) 的生产，由于 HEK293 细胞具有较高的转染效率，因此经常使用它们，这可以导致更高的病毒滴度，约为 1 × 10 13 vg.mL−1。 稳定生产细胞系（SPCLs）的基因组中整合了病毒载体生产所需的所有基因，为瞬时转染的诸多挑战提供了一种解决方案。SPCLs 可以组成型表达载体，也可以在添加或去除诱导剂/抑制剂后表达载体。这种方法能够实现更经济高效且可放大的生产，并提高重现性、质量和安全性。SPCLs 的一个关键优势在于，它们能够维持病毒载体表达长达数周至数月，直至细胞死亡，因此非常适合连续生产。 持续稳定的包装细胞系能够延长生产周期并降低工艺成本，从而促进病毒载体的大规模生产。开发用于慢病毒载体（LV）的此类细胞系面临的一大挑战是VSV-G囊膜蛋白的细胞毒性，该蛋白广泛用于假型化。目前，缓解稳定生产细胞系中这种细胞毒性的主要策略是使用诱导系统，而近年来，人们开始探索毒性较低的替代囊膜蛋白。首批报道的持续包装细胞系是STAR细胞系，该细胞系利用了无细胞毒性的γ逆转录病毒载体囊膜蛋白，例如MLV 4070 A（Ampho）、带有HIV蛋白酶位点的RD114（RDpro）以及一种改良的长臂猿白血病病毒（GALV+）。随后，又开发了其他连续稳定生产细胞系，包括 LentiPro26、RD3-MolPack-GFP和 WinPac-RD。 四环素调控启动子系统是目前应用最广泛的用于构建可诱导包装和稳定细胞系的平台。该系统主要有两种变体：Tet-Off 系统，在四环素 (Tc) 或其类似物强力霉素 (DOX) 存在的情况下抑制转录；以及 Tet-On 系统，在 Tc 或 DOX 存在的情况下激活转录。选择合适的诱导技术需要仔细权衡其各自的优缺点，包括但不限于诱导强度、基础渗漏（定义为在没有诱导剂的情况下病毒基因或转基因的非预期低水平表达，这会影响细胞系的稳定性）以及在下游步骤中去除诱导剂分子的难易程度。 四环素抑制系统是构建可诱导慢病毒稳定生产细胞系最常用的方法。该系统通过将四环素阻遏蛋白（tetR）与单纯疱疹病毒VP16蛋白的C端结构域融合，构建四环素控制的转录激活因子（tTA）。随后，通过将tTA稳定转染至HeLa细胞，构建了HtTA-1诱导型细胞系。在没有四环素的情况下，tetR序列与四环素反应启动子元件（TRE）结合，激活靶基因的转录。在四环素存在的情况下，tTA发生构象变化，从而无法与TRE结合，进而抑制基因表达。由于其半衰期较长且所需浓度较低，合成的四环素衍生物强力霉素常用于四环素抑制系统中。 利用这种方法已开发出多种细胞系，包括第三代GPR细胞系，该细胞系使用tet-off系统调控tat和rev的表达。通过串联体阵列技术插入转基因，实现了高滴度的慢病毒（LV）。这些包装细胞已被用于临床生产慢病毒，以治疗X连锁重症联合免疫缺陷和Wiskott-Aldrich综合征。最近，葛兰素史克公司通过稳定转染单个DNA构建体，开发了一种悬浮细胞系。该细胞系可在搅拌罐式生物反应器中扩增至接近9 × 10⁶ cells/mL的密度，并可编码绿色荧光蛋白或人β-珠蛋白。 最近，EurekaBio公司开发了EuLV™，这是一种可诱导的稳定生产细胞系平台，适用于悬浮培养系统，用于慢病毒（LV）的生产。该平台符合GMP生产规范，并已应用于Ucello公司的CD19 CAR-T疗法研发管线，成为首个使用稳定细胞系来源的慢病毒生产的、获得IND批准的CAR-T疗法。据报道，EuLV™的上清液滴度达到5–6 × 10⁸ TU /mL。相比之下，传统瞬时转染方法的病毒滴度约为1E7 TU/mL。然而，其精确的潜在调控机制尚未公开。 其他诱导表达系统包括 tet-on 系统。反向四环素阻遏蛋白 (rTetR)是通过对负责四环素依赖性阻遏的四个氨基酸进行随机诱变而构建的。与 tet-off系统类似，rTetR 与 VP16 融合形成。在四环素或强力霉素存在的情况下，rTetR 与 TRE 结合并激活转录。Oxford Biomedica利用 tet-on 系统生产了编码ProSavin® 的第三代 EIAV 衍生慢病毒载体，用于体内神经元转导以表达多巴胺，从而治疗帕金森病。在 PS5.8 和 PS46.2 细胞系中，载体基因组是组成性表达的，而强力霉素诱导 EIAV Gag/Pol 和 VSV-G 囊膜蛋白的表达。 将PS46.3细胞系适应悬浮培养后，其滴度从4.5 × 10⁵ TU/mL降低至2.5 × 10⁴ TU/mL。通过在四环素开启系统中添加枯草杆菌蛋白酶开关，进一步改进了调控系统。利用此方法构建了HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92和293SF-PacLV细胞系，这些细胞系适应了无血清悬浮培养，从而实现了大规模临床级慢病毒的生产。 最近，研究人员开发了一种Tet-On诱导型生产细胞系（PCL），用于在DOX诱导后生产VSV-G假型慢病毒（LV）。为了验证该稳定细胞系（SCL）平台的临床应用价值，研究人员构建了一个概念验证模型，即编码GFP-CAR融合蛋白的SCL。通过添加DOX诱导LV的产生，并基于功能性和物理性病毒滴度进行评估，同时将结果与未添加诱导剂DOX时的基础产量水平进行比较。在SCL-CAR模型中，诱导使病毒滴度提高了约20倍，达到5.9 × 10⁶ TU /mL。通过优化DOX浓度，在不影响生产率的情况下将诱导剂浓度从2 μg/mL降低至1 ng/mL，进一步提高了工艺性能。值得注意的是，所有测试浓度，包括最低浓度（1 ng/mL），均产生了相当高的LV滴度，表明即使在极低的DOX浓度下也具有强大的诱导能力。这种优化降低了收获液中残留的DOX，从而有利于下游工艺纯化，并确保最终产品质量符合要求。通过qPCR定量整合的辅助基因拷贝数，也证实了基因组的稳定性，该拷贝数在整个培养过程中保持稳定。在不添加DOX的情况下，基础LV产量低于检测限（1.5 × 10⁴ TU /mL），表明转录受到严格调控。 对于腺相关病毒（AAV）而言，主要有两种策略：一是构建含有rep/cap基因但需要递送载体基因组的包装细胞系；二是构建同时含有rep/cap基因和rAAV基因组的生产细胞系。由于HEK293细胞中REP转录激活因子E1A基因的组成型表达会导致细胞抑制性rep蛋白的表达（通过激活p5启动子），因此利用HEK293细胞作为构建rAAV包装和生产细胞系的基础较为复杂。这意味着HEK293细胞只能与诱导系统结合使用，才能构建稳定的包装/生产细胞系。 基于HeLa和A549细胞的系统已取得进展，这些系统能够可靠地扩增rep/cap基因，并且比质粒转染的滴度显著更高。然而，依赖腺病毒或HSV1等辅助病毒带来了安全性和监管方面的挑战，包括共生产和审批验证的风险。近期的一些创新，例如TESSA（四环素增强的自沉默腺病毒）平台，通过改造腺病毒的主要晚期启动子（MLP），使其能够自我抑制启动子活性并缩短腺病毒复制周期，从而实现无污染的rAAV生产。这种方法通过腺病毒的自限性复制减少了辅助病毒的污染，同时仍能有效诱导rep和cap的表达，从而产生更多感染性病毒颗粒并减少杂质。最近，研究人员利用无血清生产工艺开发了一种源自HeLa细胞的rAAV SPCL，其生产效率和产品质量与传统的基于血清的方法相当，同时缩短了细胞系开发时间，并消除了血清补充带来的挑战。利用该平台，生产rAAV 5型载体的PCL的体积生产率超过了1 × 1011 vg/mL。这代表着基因治疗生产领域的一项进步，提高了工艺的稳健性和监管合规性，从而有助于更广泛的患者获得基因治疗产品。 由于腺病毒E1A基因的组成型表达，HEK293细胞在rAAV包装和生产细胞系的构建中引入了诸多复杂性。E1A基因会激活p5启动子并驱动细胞抑制性Rep蛋白的表达。因此，基于HEK293的包装或生产细胞系需要严格控制的诱导系统来调控Rep蛋白的表达。基于HEK293的诱导型生产细胞系的进展尤为令人瞩目，克服了早期由组成型Rep蛋白表达带来的限制。Cre/Lox和枯草杆菌蛋白酶/香豆霉素转换系统目前能够实现对Rep蛋白激活的精确控制。利用该诱导系统，Rep68 和 Rep40 的表达足以产生重组腺相关病毒 (rAAV)，从而获得稳定的细胞克隆，其病毒滴度可与三质粒转染法相媲美甚至更高，同时最大限度地减少了具有复制能力的腺病毒。另一项研究利用CRISPR-Cas9 技术将 AAV 组分整合到特定的基因组安全位点。然而，目前的 HEK293 T 稳定细胞系的病毒产量仍然低于瞬时转染，需要进一步优化诱导控制和基因剂量。更新的研究已将腺病毒辅助功能整合到 HEK293 或 CAP 衍生细胞系中，例如 CEVEC（现为 Cytiva）开发的 ELEVECTA 平台。这些可诱导的“一体化”生产线可放大到工业规模。 与此同时，基于昆虫细胞的OneBac系统也从多杆状病毒感染简化为更简单的包装细胞形式。整合了rep/cap基因的稳定Sf9细胞系允许使用携带载体基因组的单一重组杆状病毒进行诱导。更新的版本（OneBac 2.0及更高版本）减少了辅助DNA的共包装，优化了VP1的表达，并放大了对多种血清型的兼容性。这些系统兼具可放大性和成本效益，但由于哺乳动物载体具有更高的体内效力，因此哺乳动物系统仍然是临床应用的首选。 总体而言，最新一代AAV稳定细胞系，特别是人源诱导型生产系统，代表着向稳定、大规模载体生产迈出的重要一步。它们能够降低对辅助病毒的依赖性、提高病毒颗粒质量并降低成本，使其成为未来商业化AAV生产的领先策略。值得注意的是，Shape Therapeutics开发了一种专有的、基于人源的、无血清、悬浮培养适应性强、可诱导表达的细胞系，该细胞系的所有rAAV生产组分均稳定整合到基因组中，从而简化了任何规模的rAAV生产。这项技术体现了在商业化生产环境中利用稳定生产细胞系的趋势。诱导调控、血清型灵活性和上游生物工艺优化方面的持续改进，很可能将引领该领域的下一波发展浪潮。 利用稳定细胞系进行连续生物工艺有望简化生产流程，并提供比目前瞬时转染工艺更高的批次产量。然而，为了充分发挥稳定细胞系的潜力，研发工作应着重于通过自动化筛选流程来缩短研发时间、提高特异性生产率以及确保长期遗传稳定性。 病毒载体生产的补料和收获方法 病毒载体（VV）生产的细胞扩增和收获阶段通常采用批次培养模式，这会限制体积生产率和病毒载体滴度。这通常是由于抑制性代谢物的积累和营养物质的消耗，从而限制细胞密度或导致病毒载体失活。为了解决这些问题，灌流培养常被用于持续供应新鲜培养基并移除废培养基，同时保持生物反应器内体积恒定。这可以提高细胞密度并延长生产周期，从而在保持病毒载体功能的同时，获得更高的病毒载体滴度。 在瞬时转染过程中采用灌流培养相比批次培养具有诸多优势。如前所述，通过灌流更换反应器中的转染培养基可以减轻转染试剂的细胞毒性。此外，培养基的更换允许进行重复和分批转染，从而延长生产窗口期。批次培养还受到“细胞密度效应”（CDE）的限制，即高细胞密度会导致营养物质匮乏和代谢废物含量高，从而降低转染效率。 连续生物工艺可以通过持续补充营养物质和去除抑制性代谢物来规避细胞死亡效应（CDE）。Lavado -García等人利用放大基因表达（EGE）方法强化HEK293细胞培养中病毒样颗粒（VLP）的产量，证实了这一点。通过持续更换培养基和细胞再转染，他们实现了转染后长达168小时的连续产品收获。然而，该研究表明，即使更换培养基，CDE最终也会限制168小时后的产量。为了克服这一问题，研究人员提出在收获点（转染后168小时）引入细胞废弃步骤。这样既可以收集大量VLP，又可以通过持续灌流维持目标细胞密度，并启动一个新的、优化的转染周期。 另一项研究发现，在转染前立即进行灌流可提高AAV衣壳的产量。研究人员推测，由于培养基和营养物质的持续供应，细胞保持在对数生长期，这反过来又提高了转染细胞密度和体积生产率。类似地，Tran和Kamen的研究表明，与批次培养模式相比，通过转染前每日灌流和转染后假灌流来获得高细胞密度可提高慢病毒（LV）的产量。在假灌流中，培养基每天手动更换：将培养物离心，部分或全部弃去上清液，然后将细胞重悬于新鲜培养基中。Mendes等人也报道，在批次培养模式下，转染时较高的活细胞密度会导致每个细胞的AAV滴度降低。相反，其他研究发现，转染过程中的灌流可以提高AAV的产量，这表明更换培养基和去除抑制性代谢物可以减轻细胞密度效应（CDE）。因此，在有效的灌流策略支持下，转染时细胞密度越高，细胞特异性产量可能越高。 与传统的批次培养模式相比，连续生物工艺的另一个优势在于最大限度地缩短了对温度敏感的病毒载体（VV）在生物反应器中的停留时间。慢病毒（LV）的半衰期通常比腺相关病毒（AAV）短，在37℃下约为15-16小时，这可能导致长时间培养后感染力下降。相比之下，AAV在37℃下通常表现出更好的稳定性，尽管某些血清型的效力可能会随时间推移而降低。不同AAV血清型的效力下降程度可能有所不同。例如，对在37℃下培养长达72小时的AAV9载体进行详细的效力评估显示，其效力持续且近乎线性下降，在70小时时效力降低了约50%。因此，虽然AAV不像LV那样面临半衰期有限的问题，但其稳定性和感染性仍然会受到温度的影响。缩短上游工艺中的暴露时间还可以降低自体转导的风险，自体转导是指载体转导生产细胞，导致细胞死亡和载体丢失的现象。 研究表明，为优化产品滴度，最佳灌流速率可在每天0.5至2个罐体积（VVD）之间变化。确定理想的灌流速率至关重要，因为过低的灌流速率会导致抑制性代谢物的积累和营养物质的消耗。相反，过高的灌流速率会增加培养基的消耗，从而增加成本，并由于体积增加而给下游工艺带来挑战。灌流速率的实现策略多种多样。Valkama等在一项使用固定床生物反应器的LV灌流研究中展示了一种方法，即根据生物反应器中葡萄糖和乳酸的浓度来调整灌流速率，而不是使用固定速率。此外，当将细胞接种到葡萄糖浓度较低的培养基中，并结合可调节的灌流速率时，生产力保持在与恒定灌流和高葡萄糖浓度相当的水平，并且还具有减少培养基消耗的额外好处。 灌流是高效病毒载体生产的关键技术，它通过持续供应营养物质和去除代谢产物，在维持最佳培养条件的同时，实现高细胞密度培养。这减轻了细胞密度降低（CDE）的影响，并提高了特异性生产率和体积生产率，尤其是在瞬时转染系统中。灌流还能促进细胞快速生长和提前收获，从而缩短整体生产周期，这对于慢病毒载体（LV）等温度敏感型载体尤为有利，因为长时间培养会导致载体降解。结合其可放大性、稳定性以及与GMP要求的兼容性，灌流是一种极具吸引力的、稳健高效的病毒载体生产策略。 贴壁培养和悬浮培养的放大平台 细胞培养平台的选择取决于细胞系是贴壁细胞还是悬浮细胞。病毒载体的预期应用和所需规模也会影响这一选择。传统的二维（2D）培养容器可以产生足够的病毒载体，用于学术研究和临床前研究，并可能用于自体体外基因治疗。然而，对于需要更高病毒剂量的应用，例如体内或异体体外治疗，则需要更具规模化生产能力的方法。下文将介绍这些技术在连续生产中的优势和局限性。图2总结了本节讨论的不同细胞培养技术。 贴壁细胞需要附着表面才能促进细胞生长和病毒生产，它们常用于小规模工艺开发。贴壁细胞培养结合灌流技术，无需将细胞与培养基分离，即可从上清液中连续收集病毒载体（VV）。这种方法尤其具有吸引力，因为大多数现有的病毒生产细胞系都是以这种方式培养的。 小规模LV生产通常在面积为25至500 cm²的培养皿或T瓶中进行。为了提高生产能力，通常会使用额外的培养容器来增加贴壁培养表面积。然而，T瓶占用大量培养箱空间，且人工维护费时费力，容易造成污染。多层培养系统可以解决规模化生产时对更大空间占用的需求，因为它们由多个相互连接的垂直堆叠的生长表面组成，从而形成较大的培养表面积。由于这些培养容器组合成一个整体，因此可以对整个系统进行接种和培养基更换。目前有多种培养容器可供选择，例如HYPERFlask™和HYPERStack®（康宁），它们的生长表面积分别高达1720 cm²和18000 cm²。然而，使用这些静态培养系统生产病毒载体存在一些常见局限性，例如可能出现浓度梯度以及无法监测和控制关键过程参数。多层系统的另一个挑战是难以通过显微镜监测细胞生长，层间气体交换均匀性令人担忧，而且只能通过手动开放式操作实现伪灌流，这些操作既费时费力又容易受到污染。 因此，为了满足临床和监管要求，并建立真正连续的上游工艺平台，病毒载体生产必须过渡到更具可放大性的反应器。其他可行的贴壁细胞培养技术包括中空纤维生物反应器和固定床反应器。 中空纤维生物反应器（HFB）由一个包含数千个平行排列的毛细管膜的滤芯组成（图2D）。培养基持续流经纤维内部的毛细管空间，以促进气体和代谢物的传输。该空间与纤维外部的毛细管外空间之间由半透膜隔开。这些滤芯可提供各种膜化学性质和截留分子量。独立的培养基流和收获流使得生产细胞和载体能够保留在培养空间内。由于产物收获与进料流分离，因此可以调节载体的收获速率。跨膜压力可以控制，从而调节传质和混合。研究表明，由于中空纤维生物反应器在连续模式下具有较高的表面积体积比，因此能够支持高细胞密度。在最近的一项研究中，该系统被应用于封闭式半自动化HFB平台，用于AAV2载体的生产，从1.2 L收获液中获得了约4.9 × 10¹⁴个病毒颗粒和约6.8 × 10¹³个病毒基因组 。成本模型表明，与标准多层培养瓶系统相比，使用该HFB系统可将开放式操作步骤减少40倍以上，生产时间缩短3.6至7.5倍，总生产成本降低约20倍。 图 2.用于病毒载体连续培养的不同生物反应器配置。(A) 带 ATF 截留装置的搅拌罐反应器 (STR)；(B) 带声波沉降器截留装置的搅拌罐反应器 (STR)；(C) 带 TFDF 截留装置的搅拌罐反应器 (STR)；(D) 固定床反应器 (FBR)，图中展示了两种可能的支撑基质。上方圆圈所示为层间带有间隔网的螺旋缠绕式双层 PET 非织造材料（Univercells），下方圆圈所示为矩形聚对苯二甲酸乙二醇酯微载体（Cytiva）。(E) 带内部细胞灌流过滤器的摇摆式生物反应器。(F) 中空纤维生物反应器 (HFB)，无需截留装置。 Sheu等人利用Terumo Quantum Cell HFB扩增系统进行了一项用于慢病毒载体（LV）生产的概念验证研究。尽管HFB具有流程自动化、占地面积小、功能封闭等优势，但该研究结果并不理想，病毒载体产量与批次培养模式的对照组相比，要么相似要么更低。这可能是由于空间代谢和营养梯度形成所致，使得监测反应器内的细胞生长变得困难。此外，中空纤维生物反应器的培养表面积有限，约为2.5平方米，因此临床生产需要采用规模化生产方法。 固定床反应器 (FBR) 包含一个固定化的三维基质，该基质由高孔隙率的大载体或圆盘组成，细胞可黏附并增殖于其上。与传统生物反应器相比，固定床反应器在同等产能下显著缩小了工艺占地面积，提供了更高的体积生产率，并具有更低的总体风险。固定床对细胞的截留作用有利于载体的收获和培养基的更换，从而实现无血清培养。 多家供应商已开发出具有不同固定化基质结构和组成的固定床生物反应器。Eppendorf 的 BioBlu® 5p 采用 5 升反应器，其生长基质为 18 平方米的非织造聚酯和聚丙烯 Fibra-Cel® 圆盘，目前仅提供一种配置，若要扩大规模则需要额外的反应器。Cytiva 的 iCELLis 平台提供 iCELLis Nano 生物反应器（适用于实验室规模）和 iCELLis 500+ 生物反应器（适用于符合 GMP 标准的生产），可实现从临床前到临床规模生产的过渡，但目前尚无中型规模的反应器。 Lesch等人和Valkama等人分别成功地在FBR（特别是iCELLis）中实现了灌流模式，用于腺病毒和慢病毒的生产。然而，在FBR的运行过程中也发现了一些挑战。两项研究均发现，较高的载体压实度会导致细胞分布不均和通道化。这会导致某些区域细胞密度过高，并形成细胞聚集，从而阻碍转染试剂和质粒到达细胞，最终降低整体转染效率。由于这些限制， Valkama等人报告称，与批次培养的对照培养瓶相比，FBR系统的生产率较低。相反， Lesch等人使用FBR获得了比培养瓶对照更高的生产率，这表明性能仍然存在差异。FBR的另一个缺点是iCELLis生物反应器需要较高的接种密度，这会导致额外的准备时间和更长的细胞接种步骤。这可能会消耗更多的资源和时间。在同一项研究中，他们首先在悬浮培养中扩增细胞，从而获得了足够的细胞用于FBR接种，这使得获得更高的细胞数量成为可能。 Univercells公司开发了其自主研发的改良型FBR系统——Scale-X生物反应器。一项研究将Scale-X与iCELLis进行了比较，结果表明前者在慢病毒（LV）和腺病毒的生产中表现出相似或更高的产量，且细胞分布均匀。这归因于Scale-X生物反应器所使用的不同附着材料：一种非织造螺旋缠绕双层PET材料，层间设有间隔网。总体而言，FBR显然需要进一步优化和标准化，尤其是在细胞接种策略方面，但它们具有降低人工和材料成本的潜力。表1列出了病毒载体生产中贴壁细胞培养的典型工艺参数。 表 1.目前利用贴壁培养进行病毒载体生产的不同连续上游平台的概况。 悬浮培养技术是目前用于病毒载体生产的另一种培养方式，与大多数贴壁培养平台相比，其规模化程度更高，最高可达2000升。用于病毒载体生产的常见悬浮细胞培养技术包括摇摆式生物反应器和搅拌罐式反应器。表2总结了利用悬浮培养技术生产病毒载体的研究以及灌流操作的关键工艺参数。 表2.目前用于病毒载体生产的不同连续上游平台（采用悬浮培养法）的概况。 摇摆式生物反应器使用预先灭菌的一次性塑料袋，袋内装有细胞和培养基，剩余空间填充顶空气体（图 2E）。该塑料袋放置在摇摆平台上，围绕一个或多个轴旋转，无需叶轮或气体吹扫即可增强氧气传递和流体混合，从而营造低剪切力环境。底座单元中的加热元件维持培养温度，但较大的系统可能会出现温度梯度。气体传递可通过调节摇摆频率、角度或进气口的氧气浓度来控制。光学溶氧 (DO) 和 pH 值测量可实现在线监测和控制。Grieger等人使用 WAVE 生物反应器进行灌流培养，该反应器由一个一次性塑料袋组成，通过摇摆来确保细胞培养物中营养物质和氧气的均匀混合。该研究表明，HEK293 细胞可以适应悬浮培养和无血清培养基，用于生产腺相关病毒 (AAV)。 虽然主要用于悬浮细胞培养，但贴壁细胞也可以使用微载体或片状载体进行培养。在工作体积为25 L的50 L生物反应器中，通过在Fibra-Cel载体上扩增四环素脱表达诱导型贴壁产病毒细胞系，可以生产慢病毒（LV）。经过两次运行，在3至8天内收集了138升上清液。然而，诱导慢病毒的生产需要多次洗涤步骤和完全更换培养基以去除强力霉素。相比之下，在WAVE生物反应器中，对四环素表达诱导型病毒（EIAV）产病毒细胞系进行5 L悬浮培养，只需添加强力霉素即可诱导慢病毒表达。 搅拌罐式生物反应器（STR）是应用最广泛的反应罐形式，已被用于培养多种细胞类型。这些生物反应器包含一个叶轮，可促进传热传质、通气和混合，从而形成均匀溶液。Manceur等人、Ansorge等人和Mendes等人的研究表明，与批次培养相比，在STR中采用灌流模式进行悬浮细胞培养可提高慢病毒（LV）和腺相关病毒（AAV）的产量。STR用于LV生产的优势在于，可用于工艺开发的各种小型化生物反应器。这些反应罐能够进行高通量实验，从而在进行大规模生产之前深入了解生产过程。诸如Ambr（Sartorius）和BioLector（m2p-labs）等先进系统实现了自动化，可提供过程监控。或者，微孔板已被建立为 STR 培养的缩小模型。 尽管悬浮培养是一种可行的替代方案，但将这些细胞系应用于悬浮培养仍存在一些局限性。一些研究表明，悬浮细胞的细胞密度和生长速率低于贴壁细胞培养，这可能会阻碍病毒载体的生产。Emmerling 等人和Merten 等人对不同批次培养的研究表明，贴壁细胞培养在腺相关病毒（AAV）和逆转录病毒的生产方面优于悬浮细胞培养。此外，据报道，悬浮细胞的瞬时转染效率较低，需要更多的质粒DNA，从而增加了操作成本。悬浮培养的另一个复杂性在于，它需要细胞截留装置来在灌流过程中将细胞固定在生物反应器内。然而，尽管面临这些挑战，用于细胞和基因治疗应用的VV的生产，曾经依赖于贴壁细胞培养，现在正转向悬浮培养，这是由于需要通过工艺强化来提高工艺生产率和降低生产成本所致。 悬浮灌流培养的细胞截留装置 用于灌流悬浮培养的主要截留装置包括交替切向流过滤 (ATF) 装置、切向流过滤 (TFF) 装置以及声波沉降装置。ATF 系统（图 2A）通过交替的流动和排气循环来减少污染并维持稳定的通量。虽然 ATF 在重组蛋白行业中应用广泛，但它可能并不适用于病毒载体的生产。使用 ATF 系统生产病毒载体的研究表明，该方法存在滤饼形成、停留时间延长和病毒回收率降低等问题。此外，囊膜病毒（例如慢病毒）会吸附在 ATF 过滤器上，使得该方法并非病毒载体生产的最佳选择。 声波沉降器（图 2B）已被证实是 ATF 的一种有效替代方案，尤其适用于剪切敏感性细胞。由于病毒载体生产细胞较为脆弱，如果需要在整个生产阶段维持灌流，声波沉降器是一个理想的选择。研究还表明，声波沉降器可以降低载体在膜上积聚的风险，这是基于膜的装置中常见的问题。Gränicher等人研究了灌流模式下流感病毒的生产，比较了声波沉降器和ATF两种方法，发现前者病毒体积产量比ATF高1.5至3.0倍。Manceur等人也利用声波过滤器在3升灌流生物反应器中进行低病毒连续培养，获得了较高的病毒产量。然而，Gränicher等人关于流感病毒灌流生产的研究表明，声波沉降器腔室内的温度波动高达40℃，这会对病毒的稳定性和感染性产生不利影响，从而降低产品质量，并限制其在工业规模生物反应器中的应用。因此，需要高效的冷却系统或更高的灌流速率来提供更冷的培养基。 切向流深层过滤 (TFDF)（图 2C）是另一种新型截留装置，其特点是采用切向流模式下运行的细长管状深层过滤器。Tran和 Kamen使用 TFDF 细胞截留装置在 3 L 灌流生物反应器中评估了 LV 的生产。他们将结果与Manceur 等人使用声波过滤器的结果进行了比较。TFDF 灌流运行的累积产量提高了 1.5 至 3 倍，表明该装置非常适合 AAV 的生产。此外，Mendes 等人研究了 TFDF 和 ATF 作为截留装置，将收获和澄清步骤合并到一个单元中，这可能对工艺经济性产生积极影响。结果表明，ATF 和 TFDF 均可实现连续收获，但只有 TFDF 能够充分过滤细胞裂解液并获得更高的回收率。然而，TFDF在运行过程中会产生较大的体积输出。Tona等人报道称，在 LV 生产 3 天内可产生 6-9 倍总罐体积的滤液。因此，需要进行体积缩减步骤，可能使用单程切向流过滤 (SPTFF)或多柱层析 (MCC)。 尽管病毒载体（VV）连续生物工艺技术起源于单克隆抗体（mAb）生产，但专门针对病毒载体基因疗法的灌流技术近期已实现商业化，并具备GMP生产能力。值得注意的是，Repligen公司的KrosFlo® TFDF®可用于GMP生产中腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）的上游强化培养。富士胶片BalanCD HEK293 Perfusion A培养基采用合格的原材料，并遵循GMP标准生产，是一种化学成分明确的培养基，旨在支持强化培养和灌流过程中高密度的HEK293细胞（Fujifilm Biosciences，2026）。总而言之，这些技术体现了近年来在实现符合GMP规范的商业化连续病毒载体生产工艺方面取得的进展。 收获和澄清 病毒载体（VV）的上游工艺最终以收集产生的载体和澄清产物流告终，目的是将载体与较大的杂质（例如完整细胞、细胞碎片和培养基中的其他成分）分离。慢病毒载体（LV）可以直接从培养上清液中收集，因为它们是通过从生产细胞膜出芽释放的。相比之下，腺相关病毒（AAV）是在细胞内产生的，这可能需要额外的细胞裂解步骤，尽管某些特定的AAV血清型可以胞外释放。对于胞外产生的病毒载体（如慢病毒载体），贴壁培养工艺可以通过更换培养基进行收集。在需要细胞裂解的悬浮培养工艺中，细胞可以通过离心（在较小规模下）或使用细胞截留装置与培养基分离。灌流工艺要求细胞保留在生物反应器内或附着在生物反应器上，以便连续收集产物。 原文：A.S.Olivares, A.J.L.Aparte, D.J.Stibbs, et al., Challenges and opportunities in continuous bioprocessing of lentiviral vectors and adeno-associated viral vectors. Biotechnology Advances, 2026.