Aminopterin

2.1 本章学习目标 · 掌握抗体药物从靶点发现到上市的完整开发流程及各阶段的核心任务 · 理解靶点发现与验证的主要策略与技术方法 · 比较杂交瘤、噬菌体展示、转基因小鼠、单B细胞等先导抗体发现技术的原理及优缺点 · 了解抗体工程优化的关键策略，包括亲和力成熟、人源化和可开发性优化 · 掌握临床前研究中药效评价、药代动力学和安全性评价的核心内容 · 理解临床试验设计要点及监管审批的关键考量 · 认识计算方法在抗体药物开发各阶段的应用切入点与价值 2.2 关键概念 图2-1抗体药物开发流程关键概念导图。 本导图展示了抗体药物开发从靶点发现到上市的六大核心环节，以及贯穿始终的计算方法赋能。每个环节包含多个关键技术与决策节点，共同构成完整的药物开发价值链。 2.3 2.1 抗体药物开发概述 2.3.1 2.1.1 开发流程总览 抗体药物（Antibody Therapeutics）的开发是一个复杂而系统的工程，涵盖从基础研究到临床应用的多个阶段。一个典型的抗体药物开发流程可分为六个主要阶段：靶点发现与验证（Target Discovery and Validation）、先导抗体发现（Lead Antibody Discovery）、抗体工程与优化（Antibody Engineering and Optimization）、临床前研究（Preclinical Studies）、临床试验（Clinical Trials）以及生产与上市（Manufacturing and Marketing）[64,65]。 图2-2抗体药物开发流程总览。 从靶点发现到上市通常需要10-15年时间。各阶段括号内标注的是该阶段的典型时间跨度。值得注意的是，随着计算方法和人工智能技术的引入，各阶段的时间正在逐步缩短。 每个阶段都有明确的里程碑（Milestone）和决策关卡（Decision Gate），这种”阶段-关卡”管理模式确保了开发过程的科学性和可控性。靶点发现阶段的核心任务是识别与疾病相关的生物学靶点，并通过多种手段验证其作为药物靶点的可行性。先导抗体发现阶段利用各种抗体发现平台（如杂交瘤技术、噬菌体展示技术等）获得能够特异性结合靶点的候选抗体分子。抗体工程与优化阶段对候选抗体进行系统性改造，以提升其药学性质和成药性。临床前研究阶段通过体外和体内实验全面评估候选抗体的药效学、药代动力学和安全性。临床试验阶段在人体中验证抗体药物的安全性和有效性。最终通过监管审批后方可上市销售。 2.3.2 2.1.2 开发周期与成本 抗体药物的开发是一项耗时长、投入大的系统工程。从靶点发现到最终获批上市，整个过程通常需要10-15年的时间，总投入成本在10-30亿美元之间[66,67]。其中，临床试验阶段占据了最大的时间和资金比例。 具体而言，靶点发现与验证阶段通常需要1-3年，投入约5000万-1亿美元；先导抗体发现与优化阶段需要2-4年，投入约1-3亿美元；临床前研究阶段需要1-2年，投入约5000万-1亿美元；临床试验阶段需要6-10年，是耗时最长、投入最大的阶段，I期临床试验（Phase I）约需1-2年和2000万-5000万美元，II期临床试验（Phase II）约需2-3年和5000万-1亿美元，III期临床试验（Phase III）约需3-5年和1-5亿美元[68]。 近年来，得益于人工智能（Artificial Intelligence, AI）和计算生物学（Computational Biology）技术的飞速发展，抗体药物的开发效率正在显著提升。例如，基于深度学习的抗体结构预测工具（如AlphaFold2和IgFold）可以大幅缩短抗体结构解析的时间[50,52]，而基于机器学习的可开发性预测模型则可以在早期筛选阶段就淘汰不具有良好成药性的候选分子，从而降低后期失败的风险和成本[53]。 2.3.3 2.1.3 成功率与失败原因分析 抗体药物开发的总体成功率（从进入临床试验到获批上市的概率）约为15%-25%，显著高于小分子药物的约10%[65,68]。然而，不同治疗领域和靶点的成功率差异较大。肿瘤学领域的抗体药物开发成功率约为12%-18%，而自身免疫疾病领域的成功率可达25%-35%[69]。 抗体药物开发失败的主要原因可以归纳为以下几个方面： （1）靶点选择不当：这是临床试验失败的最主要原因之一，约占失败案例的30%-40%。靶点在疾病发生发展中的作用可能不如预期重要，或者存在代偿通路（Compensatory Pathway）使得单一靶点的干预效果有限[70]。 （2）疗效不足：即使靶点选择正确，抗体分子本身的特性（如亲和力、表位、作用机制）也可能导致疗效不达预期。约25%-30%的临床失败归因于疗效不足[71]。 （3）安全性问题：包括靶点相关毒性（On-target Toxicity）和非靶点相关毒性（Off-target Toxicity）。免疫原性（Immunogenicity）也是一个不可忽视的安全性风险，人体可能产生抗药抗体（Anti-Drug Antibody, ADA），影响药物的疗效和安全性[72]。 （4）药代动力学不理想：抗体的清除速率过快或组织渗透性不佳可能影响其在靶部位的有效浓度[73]。 （5）商业化考量：包括市场竞争激烈、患者人群过小、定价和准入策略不可行等非技术性因素[74]。 理解这些失败原因对于优化抗体药物开发策略至关重要。计算方法可以在多个层面帮助降低失败风险——通过靶点可成药性预测提高靶点选择的准确性，通过抗体-抗原相互作用模拟优化抗体分子的药效特性，通过免疫原性预测降低安全性风险等（详见第2.7节）。 2.4 2.2 靶点发现与验证 靶点发现与验证是抗体药物开发的起点，也是决定整个项目成败的关键环节。一个经过充分验证的高质量靶点是成功开发抗体药物的基础。 2.4.1 2.2.1 靶点发现策略 抗体药物的靶点通常是细胞表面受体、可溶性配体、膜结合酶等可被抗体分子接触到的蛋白质分子。靶点发现的主要策略包括[75,76]： （1）基于基因组学和转录组学的策略 全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）通过分析大规模人群队列的基因型与表型关联，识别与疾病显著相关的基因位点。将GWAS发现的遗传关联与蛋白质组学数据整合，可以揭示潜在的药物靶点。例如，PCSK9基因的功能缺失突变（Loss-of-Function Mutation）与低密度脂蛋白胆固醇水平降低及冠心病风险下降的关联，直接推动了抗PCSK9抗体（如Evolocumab和Alirocumab）的开发[77,78]。 单细胞转录组学（Single-Cell Transcriptomics）和空间转录组学（Spatial Transcriptomics）技术使研究者能够在单细胞分辨率和组织空间分辨率上解析基因表达模式，从而发现在特定细胞亚群或微环境中特异性高表达的潜在靶点[79]。 （2）基于蛋白质组学的策略 质谱分析技术（Mass Spectrometry）和蛋白质芯片（Protein Array）可以系统性地比较疾病组织与正常组织的蛋白质表达谱差异，识别差异表达蛋白。膜蛋白质组学（Membrane Proteomics）技术特别适用于发现抗体药物靶点，因为抗体药物主要作用于细胞表面或细胞外蛋白[80]。 （3）基于临床观察和文献挖掘的策略 临床实践中的观察（如某些自身免疫疾病患者在使用特定药物后出现意外改善）和系统性的文献挖掘（Literature Mining）也是重要的靶点发现途径。自然语言处理（Natural Language Processing, NLP）和知识图谱（Knowledge Graph）技术可以高效地从海量科学文献中提取靶点-疾病关联信息[81]。 （4）基于功能基因组学的策略 CRISPR筛选（CRISPR Screen）和RNA干扰筛选（RNAi Screen）等功能基因组学技术可以通过系统性地敲除或敲低基因来鉴定在特定生物学过程中发挥关键作用的靶点。高通量CRISPR筛选已成为发现肿瘤免疫治疗新靶点的重要工具[82]。 2.4.2 2.2.2 靶点验证方法 靶点发现后，需要通过多层次的验证实验来确认其在疾病中的功能角色及作为药物靶点的可行性。靶点验证通常采用以下方法[83]： （1）遗传学验证 人类遗传学证据是最强有力的靶点验证依据。如果某个基因的功能获得性突变（Gain-of-Function Mutation）导致疾病，或功能缺失性突变对该基因功能的抑制与治疗获益相关，则该基因编码的蛋白质很可能是一个有效的药物靶点。研究表明，具有人类遗传学支持的药物靶点，其临床开发成功率是缺乏遗传学支持的靶点的约2倍[70,84]。 （2）体外功能验证 利用基因敲除（Knockout）、基因敲低（Knockdown）、基因过表达（Overexpression）等技术在细胞水平上验证靶点功能。同时可以使用工具抗体（Tool Antibody）或小分子抑制剂在细胞模型中验证靶点干预的功能效果。 （3）体内动物模型验证 在疾病动物模型中通过基因工程手段（如条件性基因敲除）或药理学手段（如中和抗体）验证靶点干预的治疗效果。需要注意的是，动物模型与人类疾病之间的转化性（Translatability）是一个需要审慎评估的关键问题[85]。 （4）临床数据验证 分析已有药物的临床数据，如果已有药物通过干预同一通路或相关通路显示出临床获益，则可以为靶点提供间接的临床验证。此外，生物标志物（Biomarker）研究也可以帮助建立靶点与疾病之间的因果关系。 2.4.3 2.2.3 靶点可成药性评估 对于抗体药物而言，靶点可成药性（Druggability）评估需要考虑以下几个维度[86]： （1）靶点可及性（Accessibility）：抗体分子因其较大的分子量（约150 kDa），通常只能作用于细胞外靶点，包括细胞表面受体的胞外结构域（Extracellular Domain, ECD）和可溶性配体。评估靶点蛋白的亚细胞定位和胞外结构域的暴露程度是可成药性评估的首要步骤。 （2）靶点表达谱（ExpressionProfile）：理想的抗体药物靶点应在目标组织或细胞中高表达，而在正常组织中低表达或不表达，以确保治疗窗口（Therapeutic Window）足够宽。利用公共数据库（如Human Protein Atlas、GTEx）和临床样本的表达分析来评估靶点的组织表达分布。 （3）表位可用性（EpitopeAvailability）：抗体需要结合到靶点蛋白上的特定表位（Epitope）才能发挥功能。评估靶点蛋白表面是否存在适合抗体结合的表位区域，以及这些表位是否在功能上具有重要性（如受体-配体结合界面），对于预测抗体的作用机制（Mechanism of Action, MoA）至关重要。计算方法（如分子动力学模拟和表位预测算法）在此环节发挥着日益重要的作用（详见第2.7节）。 （4）安全性考量：通过分析靶点在关键器官中的表达情况、靶点基因敲除动物的表型以及同一通路中其他靶点的药物安全性数据，初步评估靶点干预可能带来的安全性风险。 2.5 2.3 先导抗体的发现 先导抗体发现（Lead Antibody Discovery）是抗体药物开发流程中的核心环节，目标是获得能够特异性结合目标靶点并具有初步功能活性的抗体分子。目前主流的先导抗体发现技术包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、转基因动物平台、单B细胞技术和合成抗体库技术等[87]。 图2-3先导抗体发现技术平台分类。 先导抗体发现技术可分为体内免疫方法、体外筛选方法和计算设计方法三大类。各类方法产生的候选先导抗体最终都需要经过功能筛选与表征来确认其生物学活性和成药潜力。 2.5.1 2.3.1 杂交瘤技术 杂交瘤技术（Hybridoma Technology）由Georges Kohler和Cesar Milstein于1975年首创，是最经典的单克隆抗体制备方法[18]。其基本原理是将经抗原免疫的动物脾脏B细胞（可产生特异性抗体但寿命有限）与骨髓瘤细胞（Myeloma Cell，可无限增殖但不产生抗体）进行融合，形成既能无限增殖又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。 技术流程：（1）用目标抗原免疫小鼠或大鼠，经过多次加强免疫后使动物产生强烈的免疫应答；（2）采集脾脏细胞，与骨髓瘤细胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）或电融合条件下进行融合；（3）在HAT选择培养基（含次黄嘌呤Hypoxanthine、氨基蝶呤Aminopterin和胸苷Thymidine）中筛选杂交瘤细胞；（4）通过有限稀释法（Limiting Dilution）克隆化单个杂交瘤细胞株；（5）通过ELISA、流式细胞术等方法筛选出分泌目标特异性抗体的克隆。 优势：技术成熟，设备要求相对简单；通过体内免疫过程可利用天然免疫系统的亲和力成熟机制，获得的抗体通常具有较高的亲和力和特异性；抗体经历了体内的负向选择（Negative Selection），对自身抗原的反应性较低[88]。 局限性：获得的抗体为鼠源抗体，需要进行人源化改造后才能用于临床；融合效率有限，可能丢失一些有价值的抗体产生细胞；对于免疫耐受靶点（如高度保守的人鼠同源蛋白），免疫应答可能较弱；整个过程耗时较长，通常需要3-6个月。 2.5.2 2.3.2 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术（Phage Display Technology）由George Smith于1985年首创，后经Sir Gregory Winter等人发展为抗体发现的强大工具[24,89]。该技术将抗体可变区基因（通常为单链可变区片段scFv或抗原结合片段Fab）与丝状噬菌体的外壳蛋白基因（如pIII或pVIII）融合表达，使抗体片段展示于噬菌体表面，从而实现基因型（Genotype）与表型（Phenotype）的物理连接。 技术流程：（1）构建抗体基因文库（Library），文库来源可以是免疫动物或人类B细胞的抗体基因（免疫文库）、未经免疫的健康个体B细胞基因（天然文库），或通过合成生物学方法构建的全合成文库；（2）将抗体文库转化至大肠杆菌，用辅助噬菌体（Helper Phage）救援产生展示抗体的噬菌体颗粒；（3）通过”淘洗”（Biopanning）过程进行亲和力筛选——将噬菌体文库与固定化或可溶性的靶抗原共孵育，洗去非特异性结合的噬菌体，回收特异性结合的噬菌体并感染大肠杆菌进行扩增；（4）经过3-5轮淘洗富集后，对输出的噬菌体克隆进行单克隆ELISA筛选和测序鉴定[90]。 优势：完全体外操作，不依赖动物免疫，适合对人源抗原的筛选；可以从天然文库或合成文库中直接获得全人源抗体（Fully Human Antibody），免去了人源化改造的步骤；文库多样性可达109-1011，覆盖广泛的抗体序列空间；筛选周期短，通常只需2-4周；可以通过设计特定的筛选策略（如竞争淘洗、差减淘洗）来定向富集具有特定功能特性的抗体[25]。 局限性：噬菌体表面展示的抗体片段可能与全长IgG的功能特性不完全一致；某些抗体片段在大肠杆菌中的折叠和展示效率较低；天然文库获得的抗体亲和力可能低于免疫文库，通常需要后续的亲和力成熟优化；筛选过程中可能存在偏好性选择（Selection Bias），导致某些有价值的抗体被遗漏。 2.5.3 2.3.3 转基因动物平台 转基因动物平台（Transgenic Animal Platform）通过基因工程手段将人类免疫球蛋白基因座（Immunoglobulin Locus）导入小鼠等动物的基因组中，同时灭活动物自身的免疫球蛋白基因，使其在免疫后能够直接产生全人源抗体[26]。 目前主要的转基因小鼠平台包括： （1）XenoMouse：由Abgenix公司（后被Amgen收购）开发，包含大部分人类重链和轻链可变区基因片段。多款基于XenoMouse平台开发的抗体已获批上市，包括帕尼单抗（Panitumumab，抗EGFR）和地舒单抗（Denosumab，抗RANKL）[91]。 （2）HuMab-Mouse：由Medarex公司（后被Bristol-Myers Squibb收购）开发，同样包含人类免疫球蛋白基因座。伊匹单抗（Ipilimumab，抗CTLA-4）和纳武利尤单抗（Nivolumab，抗PD-1）等重磅抗体药物均基于此平台开发[26]。 （3）VelocImmune：由Regeneron公司开发，采用了独特的策略——仅替换小鼠免疫球蛋白可变区基因为人类对应基因，保留小鼠恒定区基因，从而确保B细胞在小鼠体内的正常发育和成熟。所获得的嵌合抗体经过可变区移植到人IgG恒定区即可获得全人源抗体。Dupilumab（抗IL-4Rα）等多个成功药物基于此平台开发[92]。 （4）OmniRat/OmniChicken：由Open Monoclonal Technology（现为Ligand Pharmaceuticals）开发的大鼠和鸡的转基因平台，可以产生带有人类可变区的抗体，进一步扩展了物种来源的多样性[93]。 优势：直接产生全人源或人源化抗体，无需后续人源化改造；利用体内免疫系统的亲和力成熟和负向选择机制，获得的抗体通常具有高亲和力、高特异性和良好的生物物理特性；抗体以天然的IgG形式产生，功能完整[94]。 局限性：平台构建成本高昂且受知识产权保护限制；对于与小鼠同源蛋白高度保守的人源靶点，仍然可能面临免疫耐受的问题；转基因小鼠的免疫库多样性可能低于正常小鼠或人类。 2.5.4 2.3.4 单B细胞技术 单B细胞技术（Single B Cell Technology）通过从免疫动物或人体中直接分离产生特异性抗体的单个B细胞，获取其抗体基因进行表达和功能鉴定[95]。 技术流程：（1）使用荧光标记的抗原探针（Antigen Probe），通过荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）或微流控芯片从外周血、淋巴组织等样本中分选出抗原特异性B细胞；（2）对单个B细胞进行逆转录和抗体可变区基因的巢式PCR（Nested PCR）扩增；（3）将扩增得到的重链和轻链可变区基因克隆至表达载体，进行重组表达和功能验证[96]。 近年来，基于微流控技术（Microfluidics）和液滴封装（Droplet Encapsulation）的高通量单B细胞分析平台大幅提升了筛选通量。例如，Beacon OptoFluidic系统和10x Genomics平台可以同时对数千至数万个单B细胞进行抗体基因测序和功能筛选[97,98]。 此外，从人体中分离抗体的策略也日益受到重视。从传染病康复患者或接种疫苗个体中分离抗原特异性记忆B细胞或浆细胞（Plasma Cell），可以获得经历了体内亲和力成熟的高亲和力人源抗体。这一策略在新冠病毒（SARS-CoV-2）中和抗体的快速发现中发挥了重要作用[99,100]。 优势：可以直接获得天然配对的重链和轻链序列，保留了抗体的原始配对信息；从人体中分离的抗体为全人源抗体，具有良好的安全性特征；可以挖掘稀有B细胞克隆中的独特抗体[101]。 局限性：对设备和技术要求较高；从外周血中分离抗原特异性B细胞的效率取决于免疫应答的强度；需要针对每个靶点制备高质量的荧光标记抗原探针。 2.5.5 2.3.5 合成抗体库技术 合成抗体库技术（Synthetic Antibody Library Technology）利用合成生物学和组合化学方法，通过理性设计构建多样化的抗体基因文库[102]。 与天然抗体文库不同，合成抗体库的设计基于对天然抗体库多样性的统计分析和对抗体结构-功能关系的深入理解。典型的设计策略包括： （1）基于框架区的文库设计：选择一个或少数几个经过优化的框架区（Framework Region, FR）骨架，仅在CDR区域引入多样性。这种策略可以确保文库中的抗体具有良好的稳定性和可表达性。例如，基于Herceptin（曲妥珠单抗）骨架构建的合成文库已成功应用于多个靶点的抗体发现[103]。 （2）CDR多样性的理性设计：根据天然抗体CDR的氨基酸使用偏好和长度分布，通过混合碱基合成（如NNK、TRIM等密码子策略）或精确DNA合成技术引入定向多样性。近年来，基于机器学习的CDR序列设计方法可以更精准地模拟天然免疫库的多样性模式[104]。 （3）超大容量文库：利用核糖体展示（Ribosome Display）或mRNA展示（mRNA Display）等无细胞展示技术，可以构建容量达1012-1014的超大合成文库，远超噬菌体展示文库的典型容量[105]。 优势：文库设计完全可控，可以针对特定需求定制多样性；消除了对动物免疫的依赖；可以规避知识产权障碍；文库质量一致性好，可重复使用[106]。 局限性：文库设计的合理性高度依赖于对抗体结构-功能关系的理解水平；合成文库可能缺乏天然免疫过程中产生的某些独特结构特征；从头设计的抗体可能需要更多的后续优化工作。 2.6 2.4 抗体工程与优化 在获得初始的先导抗体后，通常需要经过系统的工程改造和优化，以提升其作为药物的各项关键属性，最终获得满足临床开发要求的候选药物分子（Clinical Candidate）[64]。 2.6.1 2.4.1 亲和力优化 亲和力（Affinity）是衡量抗体与抗原结合强度的关键参数，通常以解离常数K_D表征。对于大多数治疗性抗体，K_D值在纳摩尔（nM）到皮摩尔（pM）范围内是理想的[107]。需要指出的是，亲和力并非越高越好——超高亲和力可能导致抗体与靶点结合后难以解离，影响组织渗透和肿瘤穿透效率（“结合位点屏障效应”，Binding-Site Barrier Effect）[108]。 亲和力优化（Affinity Maturation）的主要策略包括： （1）随机突变策略：通过易错PCR（Error-Prone PCR）、DNA改组（DNA Shuffling）或链交换（Chain Shuffling）在抗体可变区随机引入突变，构建突变文库后通过展示技术筛选高亲和力变体[109]。 （2）定点突变策略：基于抗体-抗原复合物的结构信息或计算模拟结果，在CDR的关键残基位点进行定点饱和突变（Site-Directed Saturation Mutagenesis），构建小型但高质量的突变文库进行筛选[110]。 （3）计算辅助策略：利用分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation, MD）、自由能微扰计算（Free Energy Perturbation, FEP）和基于结构的设计（Structure-Based Design）等计算方法，预测能够提升亲和力的突变位点和氨基酸替换（详见第2.7节和第8章）[111,112]。近年来，基于深度学习的方法（如使用蛋白质语言模型进行突变效应预测）在亲和力优化中展现出巨大潜力[113]。 （4）热点区域丢饱和策略（Look-Through Mutagenesis, LTM）：系统性地将CDR中每个位置替换为代表不同化学性质的约9种氨基酸，构建定义明确的小型文库，评估每个位置的氨基酸偏好，然后组合有益突变[114]。 2.6.2 2.4.2 特异性优化 特异性（Specificity）是指抗体仅与目标靶点结合而不与其他分子发生交叉反应（Cross-Reactivity）的能力。理想的治疗性抗体应具有高度的靶点特异性，以避免脱靶效应（Off-Target Effect）导致的安全性问题[115]。 特异性优化的关键策略包括： （1）负向筛选：在亲和力筛选过程中加入负向筛选步骤，将候选抗体与非靶点蛋白质（包括靶点家族中的同源蛋白和人血浆/血清蛋白等）共孵育，去除与之结合的非特异性克隆[116]。 （2）多特异性试剂（Polyspecificity Reagent, PSR）检测：使用生物素化的CHO细胞裂解物、DNA、胰岛素等一组多特异性试剂，通过流式细胞术或ELISA检测抗体的非特异性结合倾向。多特异性评分（Polyspecificity Score）可以作为抗体可开发性的重要预测指标[117]。 （3）计算预测与优化：通过分析抗体表面的疏水补丁（Hydrophobic Patch）分布、电荷分布和分子动力学模拟中的非特异性相互作用，识别导致非特异性结合的结构特征并进行定向优化[53]。 2.6.3 2.4.3 稳定性与可开发性优化 可开发性（Developability）是指抗体分子从实验室规模向临床和商业化规模开发过程中的技术可行性，涵盖稳定性、溶解性、粘度、聚集倾向等多个药学属性[118]。 图2-4抗体可开发性评估指标与决策流程。 可开发性评估涵盖热稳定性、胶体稳定性、化学稳定性、溶解性、粘度、聚集倾向和免疫原性风险等多个维度。不满足标准的候选抗体需要经过工程优化后重新评估。 （1）热稳定性优化：抗体的热稳定性通常以熔解温度（Melting Temperature, T_m）表征。Fab区域的T_m通常是抗体整体稳定性的限速因素。通过引入稳定化突变（如改善VH/VL界面的疏水堆积、引入额外的二硫键、优化CDR的构象稳定性等）可以提升T_m值。计算方法如Rosetta ddG和FoldX可以预测突变对稳定性的影响[119]。 （2）聚集倾向优化：抗体聚集（Aggregation）是影响药品稳定性、安全性和生产工艺的关键问题。聚集倾向与抗体表面的疏水暴露区域（Aggregation-Prone Region, APR）密切相关。通过计算工具（如Zyggregator、TANGO、CamSol）可以预测APR并指导优化突变的设计[120,121]。 （3）化学稳定性优化：CDR区域中容易发生化学修饰的”热点”残基，如天冬酰胺（Asn）脱酰胺位点（特别是NG、NS、NT等序列模体）和甲硫氨酸（Met）/色氨酸（Trp）氧化位点，需要在早期通过点突变加以消除[122]。 （4）高浓度制剂相关优化：皮下注射（Subcutaneous Injection）给药要求抗体在高浓度（通常>100 mg/mL）下仍具有可接受的粘度（通常<20 cP）和溶解度。高粘度通常与抗体分子间的可逆自结合（Reversible Self-Association, RSA）有关，可以通过优化抗体表面的电荷分布来改善[123,124]。 （5）人源化（Humanization）：对于来源于小鼠杂交瘤的鼠源抗体，人源化改造是将其开发为人用药物的必要步骤。经典的CDR移植方法（CDR Grafting）将鼠源抗体的CDR区域移植到人源框架区骨架上[23,125]。然而，简单的CDR移植往往导致亲和力下降，需要通过回复突变（Back Mutation）恢复某些关键的框架区残基。计算方法（如同源建模和分子动力学模拟）可以辅助识别这些关键的回复突变位点（详见第9章）[126]。 2.6.4 2.4.4 效应功能工程 抗体的效应功能（Effector Function）主要由Fc区域介导，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity, ADCC）、补体依赖性细胞毒性作用（Complement-Dependent Cytotoxicity, CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis, ADCP）等[127]。 根据不同的治疗目标，需要对效应功能进行定向工程改造： （1）增强效应功能：对于需要依赖ADCC或CDC机制清除靶细胞的抗体（如抗肿瘤抗体），可以通过Fc区域突变（如S239D/I332E双突变增强与FcγRIIIa的结合）或糖基化工程（如去除核心岩藻糖修饰，即无岩藻糖化Afucosylation）来增强效应功能[128,129]。 （2）消除效应功能：对于仅需发挥靶点阻断或中和作用而不需要杀伤靶细胞的抗体（如中和抗体），需要通过Fc区域突变（如L234A/L235A”LALA”突变或引入IgG4的铰链区序列）消除或减弱效应功能，以避免不必要的靶细胞杀伤[130]。 （3）半衰期调节：通过引入Fc区域的YTE突变（M252Y/S254T/T256E）或LS突变（M428L/N434S），增强抗体与新生儿Fc受体（Neonatal Fc Receptor, FcRn）在酸性条件下的结合，从而延长抗体在体内的半衰期（详见第1章1.3节）[131,DallAcqua2006?]。 2.7 2.5 临床前研究 临床前研究（Preclinical Studies）是抗体药物从实验室走向临床的关键过渡阶段，其目的是全面评估候选抗体的药效学（Pharmacodynamics, PD）、药代动力学（Pharmacokinetics, PK）和安全性特征，为临床试验的方案设计和首次人体剂量（First-in-Human Dose, FIH Dose）的确定提供依据[132]。 图2-8临床前研究的核心内容与决策流程。 临床前研究包括体外药效评价、药代动力学研究和安全性评价三大模块。各模块的评价结果综合决定候选抗体是否可以进入临床试验。SPR, Surface Plasmon Resonance; BLI, Bio-Layer Interferometry; HDX-MS, Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry; TMDD, Target-Mediated Drug Disposition; ADA, Anti-Drug Antibody; CRS, Cytokine Release Syndrome; FIH, First-in-Human; IND, Investigational New Drug。 2.7.1 2.5.1 体外药效评价 体外药效评价（In Vitro Efficacy Evaluation）旨在全面表征候选抗体的生物学活性和作用机制： （1）靶点结合特征：通过表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR，如Biacore系统）和生物膜层干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI，如Octet系统）定量测定抗体与靶点的结合动力学参数（结合速率常数k_on、解离速率常数k_off和平衡解离常数K_D）[133]。 （2）表位鉴定：通过竞争结合实验（Epitope Binning）确定抗体的表位分类（Epitope Bin）。进一步通过氢氘交换质谱（Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry, HDX-MS）、交联质谱（Cross-linking Mass Spectrometry, XL-MS）或X射线晶体学（X-ray Crystallography）精确解析抗体-抗原复合物的结构和表位信息[134]。 （3）功能活性检测：根据抗体的预期作用机制设计相应的功能活性检测方法。对于受体阻断型抗体，检测其抑制配体-受体结合和下游信号通路的能力；对于细胞杀伤型抗体，检测其ADCC、CDC和ADCP活性；对于激动型抗体（Agonistic Antibody），检测其激活受体信号的能力[135]。 （4）交叉反应性：评价候选抗体与相关物种（如食蟹猴）靶点的交叉反应性，这对于后续毒理学动物种属的选择至关重要。 2.7.2 2.5.2 药代动力学研究 药代动力学研究（Pharmacokinetic Studies）评估抗体在体内的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征： （1）血浆PK参数：通过在相关动物种属（通常为食蟹猴Cynomolgus Monkey）中进行单次给药和多次给药PK研究，获取关键的PK参数，包括曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）、最大血浆浓度（C_max）、清除率（Clearance, CL）、分布容积（Volume of Distribution, V_d）和半衰期（Half-life, t₁/₂）[136]。 （2）靶点介导的药物处置（Target-Mediated Drug Disposition, TMDD）：当抗体与高表达的靶点结合后被内化降解时，会出现非线性PK特征。TMDD模型可以更准确地描述这种复杂的PK行为，并帮助预测人体PK和剂量选择[137]。 （3）免疫原性评价：检测动物体内是否产生了抗药抗体（ADA），以及ADA对药物暴露量和药效的影响。需要注意的是，动物中的ADA检测结果不能直接预测人体中的免疫原性风险[138]。 （4）PK/PD建模：建立数学模型将药物暴露量（PK）与药理效应（PD）关联起来，预测达到目标药理效应所需的有效剂量和给药方案[139]。 2.7.3 2.5.3 安全性评价 安全性评价（Safety Assessment）是临床前研究中至关重要的环节，直接决定候选抗体是否可以进入临床试验[140]。 （1）毒理学种属选择：根据ICH S6(R1)指南，毒理学研究应在药理学相关物种（Pharmacologically Relevant Species）中进行，即抗体与该物种靶点具有交叉反应性、且靶点在该物种中的组织分布和功能与人类相似。食蟹猴是最常用的毒理学种属。当抗体与非人灵长类靶点无交叉反应性时，可以考虑使用转基因动物模型或替代抗体（Surrogate Antibody）[141]。 （2）重复给药毒性研究（Repeat-Dose Toxicity Study）：在药理学相关物种中进行至少4周的重复给药毒性研究（支持首次临床试验），评估毒性靶器官、毒性程度和可逆性，确定未见明显毒性反应剂量水平（No-Observed-Adverse-Effect Level, NOAEL）[142]。 （3）组织交叉反应性研究（Tissue Cross-Reactivity, TCR）：利用免疫组织化学方法评价候选抗体与正常人体组织（通常包括一组32种以上的正常组织）的结合情况，识别潜在的非预期靶点外结合和相关的安全性风险。 （4）细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome, CRS）风险评估：通过体外全血或PBMC刺激实验评估抗体引发CRS的风险，特别是对于靶向免疫细胞或具有免疫激活功能的抗体。TGN1412事件（一种抗CD28超级激动型抗体在I期临床试验中导致严重CRS）突显了此项评估的重要性[143]。 （5）首次人体剂量推算：基于毒理学研究的NOAEL或最小预期生物学效应剂量水平（Minimum Anticipated Biological Effect Level, MABEL），结合安全系数推算首次人体给药剂量[144]。 2.8 2.6 临床开发与上市 2.8.1 2.6.1 临床试验设计 抗体药物的临床开发遵循标准的三期临床试验框架，但在试验设计上有一些特殊考量[145]。 图2-5抗体药物临床开发阶段及各阶段通过率。 从IND申报到上市的全过程。虚线标注了各阶段的典型通过率，反映了临床开发过程中层层筛选的特征。IND, Investigational New Drug; BLA, Biologics License Application; NDA, New Drug Application。 I期临床试验（PhaseI） I期试验的主要目标是评价安全性和耐受性、确定最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose, MTD）或推荐II期剂量（Recommended Phase 2 Dose, RP2D），以及获取人体PK数据。 对于肿瘤领域的抗体药物，I期试验通常在晚期肿瘤患者中进行，采用剂量递增设计（如3+3设计或加速滴定设计）。对于非肿瘤领域的抗体药物（如自身免疫疾病），I期试验可以在健康志愿者中进行，采用单次递增剂量（Single Ascending Dose, SAD）和多次递增剂量（Multiple Ascending Dose, MAD）设计[146]。 II期临床试验（PhaseII） II期试验的目标是初步评价疗效和确定最佳给药方案。II期试验通常分为IIa期（概念验证，Proof of Concept, PoC）和IIb期（剂量探索，Dose-Finding）两个子阶段。 生物标志物驱动的患者分层（Biomarker-Driven Patient Stratification）在II期试验中越来越受到重视。通过伴随诊断（Companion Diagnostics）识别最可能从治疗中获益的患者亚群，可以显著提高试验的成功率和效率[147]。 III期临床试验（PhaseIII） III期试验是确证性试验（Confirmatory Trial），通常为随机、双盲、对照试验（Randomized, Double-Blind, Controlled Trial），样本量较大（数百至数千名患者），旨在充分证明药物的疗效和安全性，为上市审批提供关键数据[148]。 近年来，以下创新性的临床试验设计策略受到越来越多的关注： ·适应性设计（AdaptiveDesign）：允许在试验进行过程中根据中期分析结果调整试验设计（如样本量、剂量、研究终点等），提高试验效率[149]。 ·篮式试验（BasketTrial）：同一种抗体药物针对具有相同生物标志物但不同肿瘤类型的多个患者队列同时进行评价。 ·伞式试验（UmbrellaTrial）：同一种疾病的患者按不同的生物标志物分层，分别接受不同的靶向治疗。 ·平台试验（PlatformTrial）：在一个共享的基础设施和对照组下，同时评价多种药物或药物组合。 2.8.2 2.6.2 生物类似药开发 随着越来越多的原研抗体药物（Reference Product）专利到期，生物类似药（Biosimilar）开发已成为抗体药物领域的重要赛道。生物类似药是指在质量、安全性和有效性方面与已获批的参照药品高度相似的生物药品[150]。 生物类似药的开发路径与原研药有本质不同，遵循”逐步递进”（Stepwise Approach）的原则： （1）分析相似性研究（AnalyticalSimilarity）：是生物类似药开发的基础和核心。需要对候选生物类似药与参照药品进行全面的分析比较，包括一级结构（氨基酸序列）、高级结构（二级/三级/四级结构）、翻译后修饰（如糖基化谱）、纯度和杂质（如聚集体、片段）、生物活性等多个维度。 （2）功能相似性研究：评价候选生物类似药与参照药品在体外功能活性（如靶点结合、效应功能、信号通路调控等）方面的相似性。 （3）临床药理学研究：通常需要进行比较PK研究和（在适当的情况下）比较PD研究，证明候选生物类似药与参照药品的PK/PD相似性。 （4）临床疗效和安全性比较研究：在与参照药品的头对头比较试验中证明临床疗效和安全性的相似性。样本量通常远小于原研药的III期试验[151]。 计算方法在生物类似药的分析相似性研究中也开始发挥作用，例如利用分子动力学模拟比较候选生物类似药与参照药品的高级结构和动态行为差异。 2.8.3 2.6.3 监管审批要点 抗体药物作为生物制品（Biological Product），其监管审批框架与小分子化学药物有所不同[152]。 （1）美国FDA审批路径：原研抗体药物通过《公共卫生服务法》第351(a)条途径申报生物制品许可申请（Biologics License Application, BLA）。生物类似药则通过第351(k)条途径申报，需要证明与参照药品的生物相似性（Biosimilarity）。如果进一步证明可互换性（Interchangeability），则可以在不经处方医师同意的情况下替代原研药品。 （2）欧盟EMA审批路径：欧盟通过集中审批程序（Centralised Procedure）审评抗体药物。EMA是全球最早建立生物类似药监管框架的机构之一，已积累了丰富的审评经验。 （3）中国NMPA审批路径：中国国家药品监督管理局（NMPA）近年来大幅加速了创新生物药的审评审批速度。2020年实施的《药品注册管理办法》引入了突破性治疗药物程序（Breakthrough Therapy Designation）和附条件批准（Conditional Approval）等加速通道[153]。 （4）关键监管考量： ·生产工艺的一致性：生物制品具有”过程决定产品”（The Process Is the Product）的特点。生产工艺的任何变更都需要通过可比性研究（Comparability Study）证明变更前后产品质量的一致性。 ·免疫原性评价：监管机构要求在临床试验中系统性地评价和报告抗药抗体的发生率及其对PK和疗效的影响。 ·上市后监测（Post-marketingSurveillance）：包括上市后安全性监测（Pharmacovigilance）和上市后研究/临床试验等 2.9 2.7 计算方法在开发流程中的应用 计算方法（Computational Methods）正在深刻地改变抗体药物的开发范式，从传统的以实验试错为主导的模式，逐步向计算驱动、实验验证的新模式转变[47,154]。 2.9.1 2.7.1 各阶段的计算辅助工具 图2-6计算方法在抗体药物开发各阶段的应用全景图。 计算方法贯穿抗体药物开发的全流程，从靶点发现阶段的知识挖掘到生产质量阶段的工艺优化，每个阶段都有相应的计算工具和方法。FEP, Free Energy Perturbation; ML, Machine Learning; PK/PD, Pharmacokinetics/Pharmacodynamics。 下面对各阶段的关键计算工具进行简要介绍（更详细的内容将在后续各专题章节中展开）： （1）靶点发现与验证阶段 ·知识图谱与文本挖掘：利用自然语言处理技术从科学文献和公共数据库中自动提取靶点-疾病-药物关联信息，构建生物医学知识图谱，辅助靶点优先级排序[81]。 ·靶点蛋白结构预测：利用AlphaFold2等蛋白质结构预测工具获取靶点蛋白的三维结构，评估其表面可被抗体结合的表位区域[50]。 ·表位预测：利用序列和结构信息预测靶点蛋白上的B细胞表位，指导抗原设计和抗体筛选策略[155]。 （2）先导抗体发现阶段 ·抗体结构预测：IgFold、ABodyBuilder2、ImmuneBuilder等专门针对抗体的结构预测工具可以快速获取抗体的三维结构，特别是CDR环的构象[51,52]。 ·抗体-抗原对接：HDOCK、ClusPro、HADDOCK等分子对接工具可以预测抗体-抗原复合物的结合模式，辅助表位-互补位分析[156]。 ·从头设计（De Novo Design）：基于深度生成模型（如RFdiffusion、DiffAb）的抗体从头设计方法，可以生成全新的抗体序列，直接绕过传统的免疫或展示筛选过程[60,61]。这一领域正处于快速发展中，有望在未来几年实现突破性进展（详见第12章）。 （3）抗体优化阶段 ·亲和力预测与优化：自由能微扰（FEP）计算和基于机器学习的突变效应预测模型（如mCSM-AB、DDGun等）可以预测突变对抗体-抗原结合亲和力的影响，指导亲和力优化实验设计[111,157]。 ·人源化设计辅助：计算方法可以辅助选择最佳的人源框架区模板、识别关键的回复突变位点、并预测人源化变体的结构和功能特性[126]。 ·可开发性预测：基于序列和结构特征的机器学习模型可以预测抗体的聚集倾向、溶解度、粘度、化学稳定性等可开发性属性，实现在早期研发阶段对候选抗体进行全面的可开发性筛选[53,117]。 ·免疫原性预测：T细胞表位预测工具（如NetMHCIIpan、IEDB）可以评估抗体序列中潜在的T细胞表位，预测免疫原性风险，指导去免疫原化（Deimmunization）设计[158]。 （4）临床前与临床开发阶段 ·PK/PD建模与模拟（Modeling and Simulation, M&S）：群体药代动力学（Population PK）建模和生理药代动力学（Physiologically-Based Pharmacokinetic, PBPK）建模可以预测抗体在人体中的PK行为，优化给药方案设计[159]。 ·临床试验模拟：基于PK/PD模型和疾病模型的临床试验模拟可以帮助优化试验设计参数（如剂量、给药间隔、样本量、研究终点等），提高试验成功概率[160]。 2.9.2 2.7.2 计算驱动的药物开发范式 图2-7传统开发范式与计算驱动开发范式的对比。 传统范式依赖于大量的实验试错和多轮迭代，耗时较长。计算驱动范式通过计算预测和虚拟筛选大幅缩小实验搜索空间，实验数据反馈用于持续优化计算模型，形成计算-实验闭环，显著提升开发效率。 传统的抗体药物开发范式以实验驱动为主，依赖于大规模的实验筛选和反复的试错优化。这种模式虽然已取得了巨大成功（已有100多个抗体药物获批上市），但在效率、成本和成功率方面仍有很大的提升空间。 计算驱动的药物开发范式（Computation-Driven Drug Discovery Paradigm）代表了未来抗体药物开发的重要方向[154]。这一范式的核心理念是： （1）设计先行（DesignFirst）：在进入实验之前，先通过计算方法对候选分子进行大规模的虚拟评估和优先级排序，显著缩小需要实验验证的搜索空间。例如，利用深度学习模型从数十亿个虚拟抗体序列中筛选出数千个最可能具有高亲和力和良好可开发性的候选序列进行实验验证。 （2）主动学习（ActiveLearning）：采用主动学习策略（Active Learning Strategy），在每一轮实验后将结果反馈至计算模型进行更新，使模型在迭代过程中不断提升预测精度。这种计算-实验闭环（Computational-Experimental Loop）可以在最少的实验次数内找到最优解[161]。 （3）多目标优化（Multi-ObjectiveOptimization）：抗体药物开发需要同时优化多个相互制约的属性（如亲和力、特异性、稳定性、溶解度等）。计算方法可以在多维属性空间中进行帕累托优化（Pareto Optimization），识别属性平衡最优的候选分子[162]。 （4）数据整合与知识积累：通过系统性地整合实验数据和计算结果，构建机构性的抗体知识库（Antibody Knowledge Base），使得在后续项目中能够复用先前积累的知识和经验，实现组织层面的学习和进步。 需要指出的是，当前的计算方法仍然存在显著的局限性。抗体-抗原相互作用的复杂性、CDR环构象的柔性和多样性、以及体内环境的复杂性等因素，使得纯粹的计算设计尚无法完全替代实验筛选和验证。然而，计算方法作为强有力的辅助工具，已经在提高开发效率、降低开发成本和缩短开发周期方面展现出切实的价值。随着算法的持续进步、训练数据的不断积累以及计算资源的日益丰富，计算方法在抗体药物开发中的角色将从”辅助”逐步提升为”驱动”（详见第12章和第13章）[54]。 2.10 本章小结 本章系统性地介绍了抗体药物从靶点发现到上市销售的完整开发流程。主要内容可以归纳为以下几个要点： 1.抗体药物开发是一个漫长而复杂的系统工程，从靶点发现到获批上市通常需要10-15年，总投入成本在10-30亿美元之间。整个开发过程可分为靶点发现与验证、先导抗体发现、抗体工程与优化、临床前研究、临床试验和审批上市六个主要阶段。 2.靶点发现与验证是开发成功的基石。基因组学、蛋白质组学、功能基因组学等多种策略可用于发现潜在靶点，而遗传学验证、体外功能验证和体内动物模型验证则用于确认靶点的有效性。具有人类遗传学支持的靶点具有更高的临床开发成功率。 3.先导抗体发现技术呈现多元化发展态势。杂交瘤技术、噬菌体展示技术、转基因动物平台和单B细胞技术各有优势和适用场景。合成抗体库和计算设计方法为先导抗体发现提供了新的途径。 4.抗体工程与优化是将先导抗体转化为候选药物的关键环节。亲和力优化、特异性优化、稳定性与可开发性优化以及效应功能工程等策略共同确保候选分子具备满足临床要求的药学属性。 5.临床前研究为临床试验的安全开展提供了科学依据。全面的药效学、药代动力学和安全性评价，以及合理的首次人体剂量推算，是确保患者安全的必要前提。 6.临床试验设计正在向更灵活、更高效的方向发展。适应性设计、篮式试验、伞式试验等创新设计策略提高了临床开发的效率和成功率。 7.计算方法正在深刻改变抗体药物开发的范式。从靶点发现阶段的知识挖掘到生产阶段的工艺优化，计算方法在每个环节都展现出了提升效率和降低风险的价值。计算驱动的药物开发范式代表了未来的重要发展方向。 2.11 思考题 1. 在选择先导抗体发现技术时，应综合考虑哪些因素？请比较杂交瘤技术与噬菌体展示技术在抗体发现中的优缺点，并讨论在何种情况下应优先选择哪种技术。 2. 为什么”具有人类遗传学支持的药物靶点具有更高的临床成功率”？请从生物学机制的角度进行分析，并举出一个具体的成功案例。 3. 抗体的可开发性评估包含哪些主要维度？如果一个候选抗体具有优异的亲和力但聚集倾向较高，应如何进行优化？ 4. 比较传统开发范式与计算驱动开发范式的核心差异。计算方法在哪些环节最有可能实现突破性的效率提升？目前计算方法面临的主要瓶颈是什么？ 5. 生物类似药的开发路径与原研药有何本质区别？分析相似性研究在生物类似药开发中处于什么地位？计算方法如何辅助分析相似性评估？ 6. 设想你负责开发一款靶向某新发现肿瘤表面抗原的治疗性抗体，请设计一个完整的开发策略，说明在每个关键决策节点如何利用计算方法提高决策质量和开发效率。 2.12 推荐阅读与资源 2.12.1 综述文章 · Carter PJ, Lazar GA. Next generation antibody drugs: pursuit of the “high-hanging fruit”. Nature Reviews Drug Discovery, 2018, 17(3): 197-223. 全面综述了抗体药物工程技术的最新进展。 · Kaplon H, et al. Antibodies to watch in 2024. mAbs, 2024, 16(1): 2297450. 每年更新一次的抗体药物管线综述，是了解行业动态的重要参考。 · Lu RM, et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science, 2020, 27: 1. 治疗性抗体开发的系统综述。 2.12.2 教科书 · Strohl WR, Strohl LM. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, 2012. 抗体工程领域的经典教科书。 · Dubel S, Reichert JM. Handbook of Therapeutic Antibodies. 2nd edition, Wiley-VCH, 2014. 治疗性抗体的全面参考手册。 2.12.3 在线资源 · The Antibody Society (https://www.antibodysociety.org/): 国际抗体学会网站，提供抗体药物审批动态和行业分析报告。 · IMGT数据库 (https://www.imgt.org/): 免疫球蛋白基因和序列的权威数据库。 · Thera-SAbDab (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/therasabdab/): 治疗性抗体结构数据库，收录了所有已获批抗体的序列和结构信息。 2.12.4 计算工具 · AlphaFold2/AlphaFold-Multimer: 蛋白质结构预测，可用于抗体-抗原复合物结构预测。 · IgFold/ABodyBuilder2: 专门针对抗体的结构预测工具。 · TAP (Therapeutic Antibody Profiler): Oxford大学开发的抗体可开发性在线评估工具。 2.13 参考文献 [134] Abbott WM, Damschroder MM, Lowe DC. Current approaches to fine mapping of antigen-antibody interactions. Immunology, 2014, 142(4): 526-535. [51] Abanades B, et al. ImmuneBuilder: Deep-learning models for predicting the structures of immune proteins. Communications Biology, 2023, 6: 575. [108] Adams GP, et al. High affinity restricts the localization and tumor penetration of single-chain Fv antibody molecules. Cancer Research, 2001, 61(12): 4750-4755. [154] Akbar R, et al. Progress and challenges for the machine learning-based design of fit-for-purpose monoclonal antibodies. mAbs, 2022, 14(1): 2008790. [126] Almagro JC, Fransson J. Humanization of antibodies. Frontiers in Bioscience, 2008, 13: 1619-1633. [115] Avery LB, et al. Establishing in vitro in vivo correlations to screen monoclonal antibodies for physicochemical properties related to favorable human pharmacokinetics. mAbs, 2018, 10(2): 244-255. [145] Baldo BA. Adverse Drug Reactions, Springer, 2016. [80] Bausch-Fluck D, et al. The in silico human surfaceome. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(46): E10988-E10997. [90] Bradbury AR, et al. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology, 2011, 29(3): 245-254. [94] Brueggemann M, et al. 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