Sisunatovir

点 击 蓝 字 关 注 我 们 汇报人：卢嘉杰 研究生一年级 今天汇报的文献题目为《Bridging antiviral drug discovery with a large language model-powered framework》，2026年发表于communications biology。该论文来自北京大学基础医学院生物医学信息学系、北京大学医学部系统生物医学研究所等机构。 病毒感染持续威胁人类健康，凸显了有效抗病毒药物的持续需求。抗病毒药物发现通常依赖两类策略：基于表型的药物发现，即 PBDD；以及基于靶点的药物发现，即 TBDD。然而，当前计算方法主要关注预测能够结合特定抗病毒相关靶点的化合物，而忽视了抗病毒表型的生物学相关性。 为解决这一问题，论文提出了 DeepAVC，这是一个由大语言模型驱动的框架，整合了用于 PBDD 的 DeepPAVC 和用于 TBDD 的 DeepTAVC。结果显示，DeepAVC 在抗病毒化合物预测方面优于现有基线方法，并且能够通过识别参与化合物—蛋白质相互作用的关键原子和残基，提供较高的可解释性。 此外，结果表明 DeepPAVC 和 DeepTAVC 彼此互补，并可协同使用。进一步的体外和体内实验也证实了 DeepAVC 的能力。最后，论文识别出 MNS 是一种新的广谱抗病毒化合物，其疗效优于 Sisunatovir。所有这些结果表明，DeepAVC 是一种用于抗病毒药物发现的有价值工具。 这篇高水平文章，并不是因为“用了大语言模型”，而是提出了一个具有普适性的抗病毒药物发现新范式：将表型驱动（PBDD）与靶点驱动（TBDD）统一到同一个LLM框架中，并通过计算预测、可解释性分析以及体内外实验验证形成完整闭环。 1 研究背景 由高传染性病毒引发的大流行，例如人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒和埃博拉病毒，长期以来对全球公共卫生构成持续且严重的威胁，并造成了大量死亡和经济损失。因此，开发有效的抗病毒疗法是应对大流行、挽救生命的紧迫任务。 目前，抗病毒策略大体可分为小分子药物和疫苗。疫苗能够有效诱导免疫反应并预防感染，而口服小分子抗病毒药物在灵活性、快速部署和较低生产成本方面具有优势，因此同样不可或缺，尤其是在疫情暴发早期。然而，传统抗病毒药物发现仍然缓慢、昂贵且劳动密集，通常需要十年以上时间和超过 20 亿美元才能将一种新药推向市场。计算机辅助药物设计方法，例如分子对接和定量构效关系建模，已被用于部分加速这一过程。不过，这些方法高度依赖人工设计的特征和人类已有先验知识，并且在覆盖庞大的类药化合物化学空间方面存在可扩展性限制。类药化合物的化学空间估计范围可达 10²³ 到 10⁶⁰ 个分子。 近年来，机器学习和深度学习的进展几乎革新了药物发现与开发的所有阶段，包括新靶点识别、分子设计与优化、疾病机制解释，以及生物标志物发现。尤其值得注意的是，面向生物学领域设计的大语言模型，已经在多个下游任务中达到最先进水平，包括蛋白质结构预测、分子性质预测和药物反应预测。基于这些进展，许多机器学习和人工智能方法被提出用于生物活性预测，包括 DeepCPI、DeepDTA、GraphDTA、DeepConvDTI、TransformerCPI、MolTrans、ColdstartCPI、DTIAM 和 GraphBAN。这些模型通常采用不同神经网络架构分别编码化合物特征和蛋白质特征，然后通过特征融合模块和下游预测器，例如多层感知机，来估计化合物—蛋白质结合亲和力。在这些方法中，还有一些专门使用化合物—抗病毒靶点相互作用数据集设计的方法，用于预测针对预定义靶点的抗病毒活性，包括 MMFA-DTA、MT-DTI、GDL 和 COVIDVS。总体而言，这些方法主要将生物活性定义为化合物与特定靶蛋白结合的能力，因此通常被称为药物—靶点相互作用预测模型。 在抗病毒药物发现领域，两种主要策略被广泛使用。第一种称为基于表型的药物发现，即 PBDD，它通过细胞实验中观察到的表型结果来识别具有抗病毒活性的化合物，例如抑制病毒复制或抑制病毒诱导的细胞病变效应，而不需要预先了解分子靶点。第二种称为基于靶点的药物发现，即 TBDD，它关注通过与特定病毒蛋白直接相互作用而发挥抗病毒作用的化合物，因此依赖关于靶点结构或功能的详细信息。 然而，当前用于抗病毒药物发现的计算方法存在若干关键限制：第一，由于缺乏大规模、高质量抗病毒表型筛选数据集，基于表型的模型不足；第二，由于缺乏针对抗病毒相关蛋白的高质量整理数据集，基于靶点的抗病毒模型受到限制；第三，化合物和靶点的特征表示仍不理想，大语言模型在这一领域的潜力尚未得到充分探索。此外，这些方法还存在 PBDD 与 TBDD 策略整合不足的问题：基于表型的预测往往缺乏机制可解释性，而基于靶点的预测则容易产生较高的假阳性率。最后，面向抗病毒化合物发现的可访问端到端网络平台仍然不足，这限制了相关方法在研究社区中的更广泛采用。 为解决这些挑战，并统一 PBDD 与 TBDD 两种策略，论文提出了 DeepAVC——一个由大语言模型驱动的深度学习框架，用于综合性抗病毒药物发现。DeepAVC 整合了两个互补模型：面向 PBDD 设计的 DeepPAVC，以及面向 TBDD 定制的 DeepTAVC。这种双模型架构使其能够灵活应用于多种抗病毒药物发现场景，从表型筛选到由蛋白质信息引导的靶点特异性化合物识别。 结果显示，DeepPAVC 相比现有基线模型表现更优，AUROC 提升了 6.16%。DeepTAVC 在靶点 warm-start 设置下达到了与最先进方法相当的表现，而在更具挑战性的靶点 cold-start 设置下，则取得了显著的 AUROC 增益。为了验证 DeepAVC 识别新型抗病毒药物的能力，研究人员将 DeepPAVC 应用于 MedChemExpress，即 MCE 化合物库，进行基于表型的虚拟筛选。体外实验确认，所选候选物中有 93.3%，即 30 个中的 28 个，至少对一种病毒表现出抗病毒活性。随后，DeepTAVC 被进一步应用于最强效候选物 MNS 的靶点反卷积分析，结果提示整合素 β1 可能是一个合理的宿主靶点。 后续机制实验表明，MNS 并不会显著影响病毒吸附、内化或进入过程，而是在病毒进入后的阶段抑制病毒复制，并伴随病毒诱导炎症反应的减弱。综合来看，这些结果支持一种宿主导向的作用模式，而这一模式可能有助于解释 MNS 的广谱抗病毒表型。为了便于使用，研究团队还开发了一个面向抗病毒药物发现的用户友好型网络平台，并提供了示例教程，以促进实际应用。总体而言，这些结果表明，DeepAVC 是一个强大且具有泛化能力的框架，可用于加速抗病毒化合物发现。 2 研究结果 DeepAVC总体框架 大多数能够感染人类的致病病毒均为RNA病毒，由于其具有较高的突变率和快速适应能力，因此更容易引发急性感染及流行性疾病。其中，逆转录病毒（Retrovirus）是一类具有代表性的RNA病毒，其特点是在复制过程中能够将RNA基因组逆转录为DNA。典型逆转录病毒的生命周期主要包括九个阶段（图1a），每一个阶段均可作为抗病毒药物开发的潜在干预节点。针对这些关键阶段相关蛋白开发抑制剂属于基于靶点的药物发现（Target-Based Drug Discovery，TBDD）策略；而在缺乏明确靶点信息时，仅依据化合物本身预测其抗病毒活性，则属于基于表型的药物发现（Phenotype-Based Drug Discovery，PBDD）策略。为了同时支持这两种研究模式，作者提出了DeepAVC框架，该框架由两个互补模型组成，即用于表型预测的DeepPAVC和用于靶点预测的DeepTAVC。 为了支持模型构建与性能评估，作者首先分别建立了适用于两种应用场景的基准数据集。对于PBDD任务，作者从ChEMBL数据库中人工整理并筛选所有基于细胞实验的抗病毒活性数据，构建了PAVC数据集（补充图1），作为DeepPAVC模型的训练数据。对于TBDD任务，作者首先整合了ChEMBL数据库和BindingDB数据库中的化合物–蛋白结合亲和力数据，构建了CPI数据集（补充图2），用于DeepTAVC模型第一阶段训练；随后进一步筛选其中与抗病毒相关的相互作用数据，建立了TAVC数据集（补充图3），用于第二阶段训练。最终构建的TAVC数据集包含234个具有不同抗病毒作用机制的靶标蛋白，包括参与病毒复制、病毒进入以及宿主免疫应答等过程的重要蛋白（图1b，补充数据2）。 DeepPAVC模型以化合物的SMILES（Simplified Molecular Input Line Entry System）表示作为输入，将其转换为二维分子图，并利用在大规模化学结构数据上预训练的大语言模型KPGT提取分子特征。随后，这些特征被输入多层感知机（MLP），输出化合物的抗病毒活性预测得分（图1c）。由于该模型仅依赖化合物本身的信息，而不需要额外冗余数据，因此具有较好的泛化能力，可应用于任意合法的小分子结构。 与DeepPAVC不同，DeepTAVC同时需要化合物和蛋白质作为输入。化合物特征仍采用与DeepPAVC相同的方法，由KPGT模型提取；蛋白质特征则由预训练蛋白质语言模型ESM-2根据输入的氨基酸序列直接生成。为了充分捕获同一模态内部以及不同模态之间的信息交互，作者将自注意力机制（Self-attention）与交叉注意力机制（Cross-attention）相结合完成特征融合，随后将融合后的化合物–蛋白质联合表示输入MLP，最终输出化合物–蛋白质相互作用预测得分（图1d）。 DeepPAVC与DeepTAVC的联合使用构建了更加完整的抗病毒药物发现策略。在PBDD应用场景中，对于一个候选化合物，首先利用DeepPAVC预测其整体抗病毒活性，然后利用DeepTAVC进一步预测其可能作用的蛋白靶标，从而推测其潜在作用机制。在TBDD应用场景中，则首先针对给定抗病毒相关靶标，利用DeepTAVC筛选具有结合潜力的候选化合物，随后再采用DeepPAVC评价这些候选分子是否同时具有抗病毒表型活性。该两步筛选策略能够有效降低假阳性率，提高具有明确靶点且具有真实抗病毒活性的候选药物的发现效率（图1e）。 图1 DeepAVC抗病毒药物发现框架概述 （a） 逆转录病毒生命周期示意图，展示了可作为抗病毒药物研发潜在干预靶点的九个关键阶段。（b） 按照抗病毒作用机制分类整理的234个抗病毒相关靶标分布情况。饼图显示了参与病毒复制、病毒侵入、宿主免疫应答及其他生物学过程相关靶标所占比例。（c） 用于基于表型药物发现（PBDD）的DeepPAVC模型架构。化合物SMILES首先经预训练分子语言模型KPGT编码，随后通过均值池化（mean pooling）获得分子整体表示，并输入多层感知机（MLP）预测化合物的抗病毒活性评分。（d） 用于基于靶点药物发现（TBDD）的DeepTAVC模型架构。化合物SMILES和蛋白质序列分别由KPGT和ESM-2进行编码，随后依次经过自注意力（self-attention）和交叉注意力（cross-attention）模块，并利用多层感知机输出化合物–蛋白质相互作用评分。（e） DeepPAVC与DeepTAVC在PBDD和TBDD两种药物发现模式中的协同应用示意图。图a由BioRender绘制（Kang, B., 2024，https://BioRender.com/r50f850）。图e中的部分图标来源于Flaticon，并依据相应许可协议使用。 DeepAVC在抗病毒化合物预测中的性能 DeepPAVC模型的预测性能在很大程度上依赖于化合物表征方式的质量。为此，作者首先在PAVC数据集上系统比较了多种分子编码策略在抗病毒化合物预测中的表现。这些编码方式包括RDKit生成的分子指纹和分子描述符，以及多个针对一维、二维和三维分子表示开发的预训练大语言模型编码器（补充说明1）。 模型性能采用受试者工作特征曲线下面积（AUROC）和精确率–召回率曲线下面积（AUPRC）进行评价。结果显示，在所有比较方法中，基于二维分子图表示的KPGT模型取得了最佳性能，其AUROC达到0.930，AUPRC达到0.926（图2a，补充图4，补充数据3）。作者认为，KPGT优异性能主要归因于其预训练过程中包含大量ChEMBL数据库中的化合物，因此能够学习到更加符合PAVC数据集化学空间分布的分子表示。基于这一结果，作者最终选择KPGT作为DeepPAVC和DeepTAVC共同使用的分子编码器。 随后，作者将DeepPAVC与多个基线模型进行了比较。其中，COVIDVS是目前唯一能够仅利用化合物信息预测抗病毒活性的开源模型，因此被作为主要对照模型。然而，由于COVIDVS最初主要针对冠状病毒抗病毒药物开发，因此缺乏广谱抗病毒预测能力。此外，作者还构建了两种基于二维分子图的图神经网络模型，即GCN和GAT，并在相同PAVC数据集上重新训练所有基线模型，以保证比较的公平性。 作者进一步比较了KPGT编码器的两种训练策略：一种是对整个模型进行微调（Fine-tuning），另一种则固定预训练编码器，仅训练分类头。与已有研究结果一致，本研究同样发现，全参数微调能够获得更好的预测性能。具体而言，经过微调的DeepPAVC模型AUROC达到0.931，而固定编码器时仅为0.907。在所有比较模型中，仅DeepPAVC的AUROC超过0.90，显示其能够仅依赖化合物信息准确预测广谱抗病毒活性。与性能最好的基线模型相比，DeepPAVC的AUROC提高了6.16%，AUPRC提高了6.26%（图2b，补充图5）。因此，作者最终选择微调后的DeepPAVC作为后续实验所采用的最终模型，其10折交叉验证结果见补充数据4。 对于DeepTAVC模型，由于现有的大多数药物–靶标相互作用（Drug–Target Interaction，DTI）预测模型主要面向广泛疾病相关蛋白，而并非专门针对抗病毒靶标，因此作者首先在一个广泛使用的公开DTI基准数据集上训练模型，以建立公平的比较基线。作者将这一通用版本命名为CADTI（Cross-Attention-based Drug–Target Interaction model）。CADTI与DeepTAVC采用完全相同的网络结构，但训练数据来源于通用DTI数据集。为了提高训练效率，作者在CADTI训练过程中固定了预训练的ESM-2蛋白质编码器，仅训练其余网络模块。 除CADTI外，作者还选择了MolTrans、TransformerCPI、DeepDTA、DeepConvDTI、DeepCPI、GraphDTA、ColdstartCPI、DTIAM以及GraphBAN共9种广泛应用的DTI预测模型作为基线。所有模型均在相同的公开数据集上重新训练和测试，以确保比较结果具有可比性。 为了更加全面地评价模型的泛化能力，作者依据验证集中化合物和蛋白质是否在训练集中出现，将测试样本划分为四种不同情景：已知化合物–已知蛋白（Seen compound–Seen protein，SS）、未知化合物–已知蛋白（US）、已知化合物–未知蛋白（SU）以及未知化合物–未知蛋白（UU）。 实验结果表明，当测试蛋白已出现在训练集中（SS和US场景）时，各模型整体均取得较高预测性能，AUROC普遍超过0.90。其中，CADTI表现最佳，在SS和US场景下分别取得0.967和0.965的AUROC；GraphBAN紧随其后，分别达到0.961和0.955。然而，当测试蛋白未出现在训练集中（SU和UU场景）时，所有模型性能均明显下降，说明未知靶标预测仍然是DTI研究中的主要挑战。尽管如此，CADTI依然保持最佳性能，在SU和UU场景下AUROC分别达到0.798和0.836，而排名第二的ColdstartCPI分别仅为0.759和0.774。因此，作者认为CADTI不仅能够在传统Target Warm-start任务中保持与当前先进模型相当的性能，而且在更加困难的Target Cold-start场景中具有明显优势，体现出更好的未知靶标泛化能力（图2c，补充数据5）。 为了进一步提升模型在抗病毒领域的预测能力，作者首先利用CPI数据集对CADTI进行预训练，使模型学习更加广泛的化合物–蛋白质相互作用规律；随后，再利用专门构建的TAVC数据集进行第二阶段微调，使模型能够适应抗病毒相关靶标。经过两阶段训练后形成最终的DeepTAVC模型，其预测性能进一步提高，AUROC由CADTI的0.8962提升至0.9154（补充图6）。这一结果说明，针对特定领域进行微调对于提高抗病毒药物发现模型的预测性能具有重要意义。 此外，作者还进一步评估了DeepTAVC在每一个抗病毒相关靶标上的预测能力。具体而言，对于TAVC数据集中的每个靶标，作者随机保留10%的化合物–靶标相互作用作为验证集，其余90%的样本用于微调预训练后的CADTI模型，从而分别建立针对单个靶标的预测模型。由于部分靶标存在严重类别不平衡，因此作者剔除了类别极度失衡的数据，以避免评价结果产生偏差。对于保留下来的每个靶标，作者报告了验证集上的AUPRC，并以该数据集中阳性样本比例作为基线进行比较。 结果显示，在所有评估的抗病毒相关靶标上，DeepTAVC获得的AUPRC均明显高于对应数据集的阳性比例，大多数靶标的AUPRC均超过0.60，说明模型具有良好的靶标预测能力。尤其是在多个宿主靶标上表现突出，包括半胱氨酰白三烯受体1（Cysteinyl leukotriene receptor 1，UniProt：Q9Y271）、β3肾上腺素能受体（Beta-3 adrenergic receptor，UniProt：P13945）以及G蛋白偶联受体183（G-protein coupled receptor 183，UniProt：P32249）；与此同时，对于多个关键病毒靶标同样取得了较好的预测效果，包括甲型流感病毒（H1N1）神经氨酸酶（Neuraminidase，UniProt：P03468）、HIV-1 Pol多聚蛋白（UniProt：Q72874）以及SARS-CoV-2复制酶多聚蛋白1ab（Replicase polyprotein 1ab，UniProt：P0DTD1）（补充图7，补充数据6）。 图2 DeepAVC模型性能评估与比较 （a） 不同分子表示方法在基于表型抗病毒化合物预测中的性能比较。柱状图表示10折交叉验证（n = 10）的平均AUROC，误差线表示标准差（s.d.），散点表示各折对应的AUROC值。比较方法包括传统RDKit生成的分子指纹及分子描述符（ECFP4/6、FCFP4/6、MACCS、RDKit描述符及分子描述符（MDs））、基于序列的分子语言模型（ChemBERTa、ChemBERTa-2、MolFormer和SELFFormer）、二维分子图预训练模型（KPGT、GROVER和MAT）以及三维结构预训练模型Uni-Mol。AUROC表示受试者工作特征曲线下面积；MDs表示分子描述符。 （b） DeepPAVC与各基线模型在基于表型抗病毒化合物预测任务中的性能比较。 （c） 在外部基准数据集上，不同药物–靶标相互作用（DTI）预测模型的性能比较。根据训练集中化合物和靶标是否出现，将测试样本划分为四种评价场景：已知化合物–已知蛋白（SS）、未知化合物–已知蛋白（US）、已知化合物–未知蛋白（SU）以及未知化合物–未知蛋白（UU）。柱状图表示平均AUROC，误差线表示标准差，散点表示各折对应的AUROC值。 利用DeepAVC虚拟筛选发现已知及新型抗病毒化合物 DeepAVC最重要的应用之一是能够在庞大的化学空间中快速完成抗病毒候选化合物的虚拟筛选。由于DeepPAVC仅需输入化合物结构信息，因此特别适合大规模高通量筛选。为此，作者选择了8个具有代表性的化合物数据库开展虚拟筛选（补充数据7），这些数据库覆盖了不同类型及不同规模的化合物，规模从10⁴至10⁸个化合物不等。例如，DrugBank主要收录FDA批准上市药物，而MedChemExpress（MCE）数据库则主要包含商业化生物活性小分子。 为了直观展示筛选结果，作者首先利用DeepPAVC提取各数据库中所有化合物的分子特征，再采用t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）方法降维至二维空间，并根据DeepPAVC预测得到的抗病毒评分进行着色。结果显示，高评分与低评分化合物形成了边界清晰、彼此分离的聚类区域，说明DeepPAVC能够有效区分具有潜在抗病毒活性的化合物与无活性化合物（图3a）。 随后，作者将预测得分0.9作为筛选阈值，对8个数据库中的所有化合物进行分类。结果显示，各数据库中预测具有潜在抗病毒活性的化合物平均约占11%，不同数据库范围介于2.3%至26.1%之间（图3b）。这说明，在PBDD应用场景下，DeepPAVC能够作为一种高效的抗病毒活性预筛选工具，在超大规模化合物库筛选过程中快速剔除约90%的无活性化合物，从而显著降低后续实验筛选成本。 作者进一步评估了DeepPAVC识别已知抗病毒药物的能力。研究首先从DrugBank数据库中收集所有FDA批准上市药物，并依据ATC（Anatomical Therapeutic Chemical）分类系统进行分组。随后，以DeepPAVC预测得分0.5作为阈值，将药物划分为预测具有抗病毒活性和预测无抗病毒活性两类，并统计十大ATC类别中预测具有抗病毒活性的药物比例。结果显示，J05类别（Systemic antivirals，用于全身治疗的抗病毒药物）具有最高比例的预测阳性化合物，明显高于其他治疗类别（图3c，补充数据8）。这一结果进一步证明，DeepPAVC能够优先识别临床已知的抗病毒药物，具有良好的生物学可信度。 除识别已知抗病毒药物外，作者还利用DeepPAVC对MCE化合物库进行了排序筛选。结果显示，ST-193、Berzosertib、Roblitinib以及HIV-1 inhibitor-8均位列预测得分最高的候选化合物。其中，HIV-1 inhibitor-8此前已有文献报道具有抗病毒活性，其与已上市抗病毒药物Etravirine的Tanimoto相似性为0.4928；而ST-193、Berzosertib及Roblitinib与任何已知抗病毒药物的最大Tanimoto相似性均低于0.2。这说明，DeepPAVC并非仅仅依赖分子结构相似性来筛选候选化合物，而能够识别具有全新分子骨架的新型抗病毒候选药物（图3d）。 与DeepPAVC不同，DeepTAVC主要面向基于靶点的药物发现。对于给定的目标蛋白，DeepTAVC能够快速筛选具有潜在结合能力并可能具有抗病毒活性的候选化合物。由于HIV至今仍是全球重要公共卫生威胁，且作为典型逆转录病毒，其生命周期包括多个可干预阶段，因此作者选择HIV-1逆转录酶（UniProt ID：Q72547）作为模型靶标开展虚拟筛选。作者首先利用DeepTAVC对DrugBank数据库进行筛选，获得预测最有可能与HIV-1逆转录酶结合的候选药物。其中包括Etravirine、Doravirine、Capravirine以及Rilpivirine（补充图8），这些药物均已获得FDA批准或正处于临床开发阶段，属于非核苷类逆转录酶抑制剂（Non-nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors，NNRTIs）。这一结果进一步证明，DeepTAVC能够准确检索已知的靶点特异性抗病毒药物。 为了进一步验证DeepTAVC发现新型抑制剂的能力，作者将筛选范围扩展至ChEMBL数据库，并采用DeepTAVC与DeepPAVC联合筛选策略（图1e）。首先，DeepTAVC对约240万个ChEMBL化合物进行预测，仅保留预测得分高于0.99的化合物，共获得68,796个初筛命中物。随后，再利用DeepPAVC重新评价这些候选分子的表型抗病毒活性，仅保留DeepPAVC预测得分同样高于0.99的化合物，最终得到7,265个候选分子。作者指出，这种两阶段筛选策略能够有效剔除虽然能够结合靶标、但缺乏真实抗病毒表型活性的假阳性化合物。 随后，作者进一步采用Lipinski五规则（Rule of Five）、Veber规则、PAINS过滤器、Brenk结构警示以及合成可及性评分等多项药物化学评价标准，对候选化合物进行进一步筛选，最终将候选数量缩减至103个。最后，采用AutoDock Vina进行分子对接，根据结合自由能排序，最终筛选出前20个最优候选化合物（图4a）。 为了评价这些候选分子的化学空间覆盖范围，作者比较了测试集、整个筛选数据库以及最终命中化合物与DeepTAVC训练集之间的最大Tanimoto相似性。结果发现，最终筛选得到的候选化合物与整个ChEMBL数据库具有相似的相似性分布，但整体低于测试集，说明这些候选化合物位于模型训练数据覆盖范围之外的化学空间。因此，作者认为，对于这类目标导向筛选结果，在解释其泛化能力时应保持谨慎（补充图9）。这一现象也反映了ChEMBL数据库规模庞大、化学结构高度多样，而训练数据难以完全覆盖整个化学空间的客观事实。 AutoDock Vina对接结果显示，所有候选化合物均能够较好地结合HIV-1逆转录酶（PDB ID：2JLE），预测结合能介于−8.33至−10.45 kcal/mol之间（补充数据9）。作者指出，HIV-1逆转录酶NNRTI结合口袋属于典型的疏水性隧道结构，能够容纳呈"蝴蝶状（butterfly-like）"构象的小分子，同时该结合口袋具有较高的构象可塑性，可适应不同类型配体。与这一结构特征一致，筛选获得的大多数候选化合物均具有双环核心骨架，这是NNRTI类药物中较为常见的结构特征，能够较好地嵌入疏水结合腔并保持构象适应能力。因此，作者认为这些候选化合物在结构上具有典型NNRTI结合模式的特征。 图3 基于DeepPAVC的广谱抗病毒化合物表型虚拟筛选 （a） 外部筛选化合物库的t-SNE降维可视化结果，颜色表示DeepPAVC预测的抗病毒活性评分（红色表示评分较高，蓝色表示评分较低）。 （b） 根据DeepPAVC预测评分阈值，对八个筛选化合物库中的抗病毒化合物与非抗病毒化合物比例进行预测。 （c） DrugBank数据库中不同解剖学治疗学化学分类（ATC）药物类别内预测抗病毒化合物和非抗病毒化合物的比例。DeepPAVC评分大于0.5的化合物被判定为预测具有抗病毒活性，评分小于或等于0.5的化合物被判定为预测无抗病毒活性。柱状图上方数字表示各ATC类别包含的化合物总数。 （d） MCE化合物库中排名靠前的候选化合物及其最相似的已知抗病毒药物。相似性数值表示候选化合物与其最接近已知抗病毒药物之间的Tanimoto相似系数。 DeepTAVC识别耐药相关突变导致的药物结合差异 为了进一步评估DeepTAVC是否能够识别病毒耐药突变对药物结合能力的影响，作者选择了HIV-1逆转录酶中三种经典的非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）耐药突变——K103N、Y181C和Y188L——作为研究对象。作者通过修改输入蛋白序列，将突变体与野生型序列分别输入DeepTAVC模型，并比较不同NNRTIs在两种蛋白上的预测结合得分。 结果显示，这三种耐药突变并未对所有NNRTIs产生一致影响，而是表现出明显的药物依赖性差异，说明DeepTAVC能够捕捉不同耐药突变对不同化学类型NNRTIs所造成的特异性影响。 对于K103N突变，多种第一代NNRTIs（尤其是Nevirapine、Efavirenz和Delavirdine）的预测结合得分均明显下降，而第二代NNRTIs整体变化较小，提示后者对这一临床最常见耐药突变具有更好的耐受性。 对于Y181C突变，第一代NNRTIs同样表现出较大的预测得分下降，而多种第二代NNRTIs仅出现轻微变化，甚至几乎保持稳定。这一结果与已有研究关于结合口袋局部构象改变导致不同药物敏感性差异的认识一致。 相比之下，Y188L突变导致多数NNRTIs预测结合得分均出现较明显下降，但Rilpivirine受到的影响相对较小，其预测得分变化明显低于其他多数NNRTIs（图4g）。 综合上述结果，作者认为，DeepTAVC能够较好地捕获经典NNRTI耐药突变所产生的药物敏感性变化模式，具有一定的生物学合理性。然而，作者同时指出，目前的分析仍属于初步研究，仅考虑了部分单点突变，并未进一步模拟多个耐药突变共同存在时的组合效应、高阶上位性（epistasis）以及与实验耐药倍数之间的定量对应关系，因此仍有进一步完善的空间。 图4 基于DeepTAVC的HIV-1靶向虚拟筛选 （a） 利用DeepTAVC针对HIV-1逆转录酶（RT）开展基于靶点虚拟筛选的整体流程，筛选数据库为ChEMBL。（b） 针对HIV-1逆转录酶筛选得到的代表性高排名候选化合物及其最相似的参考非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）。图中同时给出了各化合物的AutoDock Vina对接评分以及在所采用计算流程下获得的MM/GBSA结合自由能。（c） CHENBL234282与HIV-1逆转录酶形成复合物时的MM/GBSA结合自由能分解结果，并与Doravirine复合物进行比较。（d） HIV-1逆转录酶–CHEMBL234282复合物的MM/GBSA逐残基结合自由能分解结果，突出显示对结合贡献最大的关键氨基酸残基。（e） CHEMBL234282在HIV-1逆转录酶NNRTI结合口袋中的预测结合构象，并标注主要相互作用残基。（f） HIV-1逆转录酶晶体结构（PDB：2JLE）中共结晶配体的结合模式，作为参考。（g） HIV-1逆转录酶耐药突变K103N、Y181C和Y188L对代表性NNRTIs预测结合评分的影响（Δscore = 突变体评分 − 野生型评分）。 DeepPAVC与DeepTAVC的互补性提高了抗病毒药物发现能力 作者指出，DeepPAVC和DeepTAVC分别从不同角度描述抗病毒药物发现过程，两者具有明显的互补优势，联合应用能够有效弥补各自模型的局限性。 一方面，DeepPAVC能够作为抗病毒活性过滤器（activity filter），既能够去除DeepTAVC产生的假阳性结果，也能够补充其遗漏的真正活性化合物。作者认为，这是因为并非所有能够与靶蛋白结合的化合物都具有细胞水平的抗病毒活性；相反，一些真正具有较强抗病毒作用的化合物可能通过其他作用机制发挥效应，而这些机制并不属于特定靶标模型能够识别的范围。因此，引入基于表型的预测模型能够有效提高虚拟筛选结果的准确性和稳定性。 为了验证这一观点，作者选择流感病毒血凝素（Hemagglutinin，PDB ID：8SD2）作为代表性抗病毒靶标开展案例分析。血凝素是流感病毒侵入宿主细胞过程中发挥关键作用的重要蛋白，也是经典抗流感药物的重要作用靶点。作者从ChEMBL数据库提取与流感相关的化合物活性数据，同时分别计算DeepPAVC预测的抗病毒活性得分以及DeepTAVC预测的血凝素结合得分。 首先，以CHEMBL7004为例，该化合物在细胞实验中的EC₅₀为47.86 μM，通常被认为抗病毒活性较弱甚至无活性。然而，DeepTAVC却预测其具有较高的结合得分（0.9941），AutoDock Vina对接结果同样显示其结合自由能达到−7.7 kcal/mol，提示该化合物能够较好地结合血凝素。这属于典型的假阳性情况，即具有较强结合能力，却缺乏真实抗病毒活性。相比之下，DeepPAVC预测其抗病毒得分仅为0.0002，成功将其识别为无活性化合物。因此，DeepPAVC能够有效过滤掉DeepTAVC产生的此类假阳性结果。 相反，CHEMBL4103104则代表另一种情况。该化合物在细胞实验中的EC₅₀仅为8.32 nM，说明其具有极强的抗病毒活性。然而，DeepTAVC预测其血凝素结合得分仅为0.0001，AutoDock Vina预测结合能也仅为−3.7 kcal/mol，提示其几乎不与血凝素结合。这可能是由于该化合物通过其他抗病毒机制发挥作用，而并非直接作用于血凝素，因此属于基于靶标筛选中的假阴性。 值得注意的是，DeepPAVC却给予该化合物0.9999的抗病毒预测得分，成功识别其具有极强抗病毒活性。因此，DeepPAVC不仅能够过滤DeepTAVC产生的假阳性结果，同时还能弥补其无法识别非靶标作用机制所造成的假阴性，从而降低整体漏检率（补充图10a）。 综合上述分析，作者认为，DeepPAVC与DeepTAVC联合应用能够显著提高虚拟筛选的可靠性。DeepPAVC不仅能够剔除DeepTAVC产生的假阳性，还能够重新发现被DeepTAVC遗漏的真正命中化合物，从而实现更加全面、更加准确的抗病毒候选药物筛选。 另一方面，DeepTAVC还能为DeepPAVC筛选得到的候选化合物提供作用机制解释。为验证这一能力，作者首先利用DeepPAVC对ChEMBL数据库进行虚拟筛选，获得了一批预测具有较高抗病毒活性的候选化合物。在这些高评分化合物中，作者随机选取了CHEMBL585351作为代表，其DeepPAVC预测得分为1.0，提示该化合物具有极强的潜在抗病毒活性。 随后，作者利用DeepTAVC预测CHEMBL585351与多个已知抗病毒靶标之间的结合能力。结果显示，该化合物与HIV-1逆转录酶（UniProt ID：Q72547）的预测结合得分最高，为1.0，提示HIV-1逆转录酶可能是该化合物发挥抗病毒作用的潜在功能靶标。 为了进一步从结构层面验证这一预测结果，作者采用AutoDock Vina对CHEMBL585351与HIV-1逆转录酶（PDB ID：2JLE）进行了分子对接分析，以获得初步的计算机模拟结构信息。值得注意的是，2JLE晶体结构中的共结晶配体同样获得了DeepTAVC预测得分1.0，在作者采用的对接参数下，其Vina预测结合自由能为−9.6 kcal/mol。相比之下，CHEMBL585351获得了更优的结合能，为−11.7 kcal/mol，说明在当前计算模型下，该化合物可能具有更加稳定的结合构象。 进一步分析预测结合模式发现，CHEMBL585351与共结晶配体在HIV-1逆转录酶NNRTI结合口袋中具有高度相似的结合方式。两种配体均可与TYR188和TRP229形成π–π堆积作用，同时均能够与LYS101形成氢键。此外，CHEMBL585351还额外与ASP186形成一条氢键，这可能是其获得更优对接评分的重要原因（补充图10b）。 根据已有文献报道，2JLE晶体中的共结晶配体对HIV-1逆转录酶的IC₅₀为384 nM，同时其DeepPAVC预测得分也为1.0，说明该化合物既具有明确的靶点活性，也具有真实的抗病毒表型。由于CHEMBL585351同样具有上述预测特征，并且表现出较好的分子对接结果，因此作者认为，该化合物可作为值得进一步实验验证的新型抗病毒候选分子。然而，作者同时强调，目前所有结果均来源于计算预测，尚不能据此推断CHEMBL585351的实际IC₅₀或真实生物学活性。 综合上述分析，作者认为，DeepPAVC与DeepTAVC具有明显的协同优势：不仅能够更加准确地筛选候选化合物，而且能够进一步解析其潜在作用机制，从而建立一个兼具预测能力、可解释性和完整性的抗病毒药物发现框架。 基于DeepPAVC分子表示构建药物相似性网络用于药物重定位 药物重定位（Drug Repurposing，也称Drug Repositioning）是指发现已上市或已有适应证药物的新治疗用途。由于该策略能够显著降低研发成本、缩短研发周期，因此近年来已成为抗病毒药物开发的重要方向。 为了实现抗病毒药物重定位，作者基于DeepPAVC学习得到的分子表示构建了药物相似性网络。具体而言，作者首先利用DeepPAVC提取DrugBank数据库约1万个化合物的分子嵌入（molecular embedding），随后计算任意两个化合物之间的余弦相似度（cosine similarity）。 在构建得到的相似性网络中，每一个化合物对应一个节点；当两个节点之间的余弦相似度大于0.2时，即建立一条连接边。为了保持网络稀疏性及良好的可解释性，每个节点最多仅保留20个最近邻化合物。 为了展示该网络的应用价值，作者选择FDA批准用于治疗HIV/AIDS的抗逆转录病毒药物Dolutegravir（DTG）作为中心节点，并提取其局部相似性子网络（补充图11）。 结果显示，DTG与多种已知抗HIV药物形成了紧密聚类，包括Rilpivirine、Delavirdine、Etravirine、Nevirapine以及Zidovudine。这一结果说明，在DeepPAVC学习得到的嵌入空间中，具有相似抗病毒药理作用的化合物能够自然聚集在一起。 更值得关注的是，该子网络中还包含了一些原本并非用于抗病毒治疗的药物。例如，抗肿瘤药物Trametinib和Pazopanib均与DTG表现出较高的相似性。 作者进一步结合已有文献进行了验证。已有研究报道，Trametinib具有抑制淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染的抗病毒活性；另一方面，Pazopanib也被证实能够以剂量依赖方式抑制人肠道病毒71型（EV-A71）的复制。这些研究结果说明，这些原本用于非病毒性疾病治疗的药物可能具有尚未充分认识的抗病毒潜力，因此有望作为药物重定位的重要候选分子。 综合来看，作者认为，基于DeepPAVC构建的药物相似性网络能够有效按照抗病毒作用特征对药物进行聚类，同时为从现有非抗病毒药物中发现新的抗病毒候选药物提供了一种具有实际应用价值的计算工具。 DeepTAVC通过识别关键官能团和结合残基揭示模型可解释性 DeepTAVC模型引入了交叉注意力机制（cross-attention mechanism），用于捕获化合物与蛋白质之间的跨模态相互作用。基于这一网络结构，模型能够提取注意力权重（attention score），从而反映不同化合物原子和蛋白质氨基酸残基在结合过程中的相对重要性。 为了展示这一能力，作者选择了Doravirine与HIV-1逆转录酶形成的共晶结构（PDB ID：4NCG）作为研究对象。Doravirine是一种具有良好口服生物利用度的非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI），其能够在HIV-1逆转录酶活性口袋内形成多种稳定相互作用，从而产生较高的结合亲和力（补充图12a）。 作者利用DeepTAVC提取了Doravirine与蛋白之间的交叉注意力图（attention map），并将Doravirine各个原子的注意力得分归一化至0～1之间。结果显示，多个原子获得了较高的注意力权重，包括第3和第4位氮原子（N）、第24位氯原子（Cl）以及第25位碳原子（C）（补充图12b）。 进一步结合晶体结构分析发现，第3位和第4位氮原子能够与HIV-1逆转录酶中的LYS103形成氢键；而第24位氯原子和第25位碳原子则共同组成了Doravirine分子中的三氟甲基（trifluoromethyl）基团。该基团能够提高分子的疏水性，使Doravirine更容易进入蛋白质疏水性结合口袋，从而增强结合亲和力。上述结果说明，DeepTAVC生成的注意力图能够有效识别参与化合物–蛋白质相互作用的关键官能团及重要原子。 除了注意力图分析外，作者还采用了扰动遮蔽分析（perturbation masking analysis）进一步识别具有重要功能的化学亚结构。具体而言，作者首先利用KPGT获得输入化合物每一个原子的嵌入表示，然后依次将单个原子的特征向量替换为全零向量，实现逐原子遮蔽；随后将遮蔽后的分子重新输入DeepTAVC，并计算预测结合得分相对于原始分子的变化幅度。若某一原子被遮蔽后导致预测得分下降越明显，则说明该原子对模型预测的重要性越高。 总体来看，扰动遮蔽分析得到的结果与注意力图具有较高一致性。例如，两种方法均认为Doravirine的第3位氮原子属于最重要的关键原子之一。然而，两种解释方法也存在一定差异。注意力图更倾向于突出某些取代基的重要性，例如第24位氯原子及第25位三氟甲基；而扰动遮蔽分析则更加突出芳香环骨架内部原子的贡献，例如第10位碳原子的重要性更高（补充图12c）。 作者认为，这种差异来源于两种解释方法的本质不同。扰动遮蔽分析通过直接修改输入特征，因此更容易突出那些删除后会导致整体预测结果发生较大变化的骨架原子；而注意力图则仅反映模型内部学习到的信息分配模式，并不会真正改变分子结构。因此，两种方法提供的是互补而非重复的可解释性信息。同时作者强调，仅依据注意力权重本身并不能直接证明某一原子具有真正的因果作用，因此应结合其他解释方法共同分析。 随后，作者进一步评估DeepTAVC是否能够从蛋白质角度提供可解释性分析。为此，作者计算了HIV-1逆转录酶序列中每一个氨基酸残基的相对活性变化评分（relative activity change score）。该评分反映单个残基发生扰动后对化合物–蛋白结合能力的影响程度，绝对值越高，说明该残基在结合过程中越重要。 结果显示，位于RT_Rtv功能结构域（第44–234位氨基酸）内的残基整体具有明显高于其他区域的评分（补充图12d）。由于RT_Rtv结构域是HIV-1逆转录酶发挥催化功能所必需的核心区域，因此这一结果具有良好的生物学合理性。 此外，位于Doravirine结合口袋附近的多个关键残基，包括K101、T106、Y188和M229，均表现出较高的突变敏感性（补充图12e），提示这些氨基酸在配体结合过程中发挥关键作用。进一步分析晶体结构发现，Doravirine的苯环能够分别与TYR188和TRP229形成π–π堆积作用，这与模型预测得到的高敏感性残基完全一致，也进一步验证了DeepTAVC解释结果的可信度（图4g）。 综上所述，作者认为，DeepTAVC不仅能够在原子水平识别影响药物结合的重要化学基团，还能够在氨基酸残基水平揭示关键结合位点，从而为抗病毒药物发现提供具有机制解释能力的人工智能模型。 DeepAVC预测结果的实验验证发现MNS是一种具有广谱抗病毒活性的候选化合物 作者进一步结合体外和体内实验，对DeepAVC筛选得到的抗病毒候选化合物进行了实验验证。首先，利用DeepPAVC对MedChemExpress（MCE）化合物库（约20,000个化合物）进行虚拟筛选，以预测抗病毒评分大于0.99作为初筛标准，共获得1,810个候选化合物。随后，依据Lipinski五规则和Veber规则进行药物相似性筛选，候选化合物数量减少至854个；进一步利用PAINS和Brenk结构警示规则去除可能具有非特异性干扰作用的化合物后，最终保留543个候选分子。为了优先筛选具有新颖性的抗病毒候选药物，作者结合PubChem数据库注释及已有文献，剔除了已报道具有抗病毒活性的化合物，仅保留3种已知抗病毒药物作为阳性对照，最终确定30个候选化合物进入实验验证阶段（图5a）。为了进一步评估这些候选化合物的化学空间覆盖情况，作者比较了其与DeepPAVC训练集之间的最大Tanimoto相似性，并与测试集及整个筛选化合物库进行了比较。结果显示，这30个最终候选化合物与训练集的相似性高于整个筛选库，但仍低于测试集（补充图13），说明这些实验验证化合物主要位于模型训练数据能够覆盖的化学空间，同时仍保持一定程度的结构新颖性。 随后，作者对这30个候选化合物进行了广谱抗病毒活性评价，分别选择DNA病毒单纯疱疹病毒1型（HSV-1 F株）、正链RNA病毒脑心肌炎病毒（EMCV）和小鼠肝炎病毒A59株（MHV-A59），以及负链RNA病毒甲型流感病毒PR8株（IAV-PR8）和水泡性口炎病毒（VSV）作为代表性病毒模型，并于化合物处理后采用RT-qPCR检测病毒RNA复制水平。结果表明，在30个候选化合物中，有28个能够抑制至少一种病毒的复制，其中6个化合物能够同时显著抑制上述五种病毒，表现出良好的广谱抗病毒活性（图5b，补充数据12）。 在所有候选化合物中，13号化合物NVP-BVU972和18号化合物MNS表现出最为显著的抗病毒活性。为了进一步评价其抗病毒效果，作者以目前处于临床研究阶段的抗病毒药物Sisunatovir（9号化合物）作为阳性对照进行比较（图5c）。结果显示，MNS在10 μM浓度下即可对五种病毒均表现出极强的抑制作用，使病毒载量降低95%以上，其抗病毒效果明显优于相同浓度下的NVP-BVU972和Sisunatovir（补充数据12）。随后，作者进一步采用流式细胞术（补充图14）和Western blot实验（图5d，补充图15）进行了验证，两种实验结果均进一步证实了MNS具有优异的抗病毒活性。此外，作者利用表达绿色荧光蛋白的VSV-GFP作为报告病毒，通过荧光显微镜直接观察病毒感染情况。结果显示，三种候选化合物均能够不同程度降低病毒复制，而MNS在10 μM浓度下几乎完全消除了HeLa细胞中的VSV感染信号（图5e，补充图16）。 为了进一步评价代表性候选化合物的治疗窗口，作者测定了各化合物的细胞毒性（CC₅₀）、抗病毒活性（EC₅₀）以及选择指数（SI=CC₅₀/EC₅₀）。结果显示，MNS具有最佳的综合药效学特征，其CC₅₀为102.2 μM，EC₅₀为8.505 μM，选择指数达到12.02；相比之下，NVP-BVU972的CC₅₀为95.09 μM，EC₅₀为21.42 μM，选择指数为4.44，而Sisunatovir的CC₅₀为104.3 μM，EC₅₀为37.36 μM，选择指数仅为2.79。上述结果进一步表明，MNS所表现出的广谱抗病毒活性并非来源于非特异性的细胞毒性，而是在保持较低毒性的同时具有更高的抗病毒效力，因此较另外两种代表性候选化合物具有更大的治疗窗口和更好的开发潜力（补充图17）。 图5 DeepAVC预测结果的实验验证表明MNS是一种具有广谱抗病毒活性的候选化合物 （a） 利用DeepPAVC对MCE化合物库（约20,000个化合物）进行表型虚拟筛选的流程，包括药物相似性筛选、PAINS和Brenk结构警示过滤以及去除已知抗病毒化合物，最终获得30个候选化合物。（b） 30个候选化合物对五种病毒的抗病毒活性检测结果，采用RT-qPCR测定脑心肌炎病毒（EMCV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、甲型流感病毒（IAV）、小鼠肝炎病毒（MHV）及水泡性口炎病毒（VSV）的病毒RNA相对水平。热图颜色表示抗病毒活性强弱（颜色越深表示抑制作用越强）。星号表示与DMSO对照组相比具有统计学差异，采用双侧非配对Student's t检验分析。数据来源于3次独立生物学重复（n = 3）。ns，P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。（c） Sisunatovir（9号化合物）、NVP-BVU972（13号化合物）和MNS（18号化合物）的化学结构。（d） HeLa细胞感染VSV后分别给予Sisunatovir、NVP-BVU972或MNS（10、20、40 μM）处理的免疫印迹（Western blot）分析结果，以DMSO作为溶剂对照。GFP作为病毒蛋白表达指标，β-actin作为内参。图中展示至少3次独立实验中的代表性结果，完整印迹见补充图15。（e） HeLa细胞感染VSV-GFP后分别给予Sisunatovir、NVP-BVU972或MNS（10 μM）处理的明场及GFP荧光显微图像，以DMSO作为对照。图像为至少3次独立实验中的代表性结果。比例尺=100 μm。 靶点解析及机制研究支持MNS通过宿主靶向的病毒侵入后机制发挥抗病毒及抗炎作用 为了阐明MNS发挥抗病毒作用的分子机制，作者首先进行了靶点解析（target deconvolution）分析。首先，利用DeepTAVC模型预测MNS与234个经典抗病毒相关靶标之间的结合潜力。然而，结果显示，没有任何靶标的预测结合得分超过0.5，提示MNS不太可能通过直接作用于模型所包含的已知抗病毒相关靶标而发挥抗病毒效应。随后，作者进一步扩大了预测范围，利用CADTI模型预测MNS与CADTI框架中包含的6,193个蛋白靶标之间的相互作用，并依据预测结合得分对所有靶标进行排序。结合预测结果、已有文献证据及生物学相关性分析，整合素β1（Integrin beta-1，ITGB1；UniProt ID：P05556）被确定为最有可能的候选作用靶标，其预测结合得分高达0.9945（补充数据13）。为了初步评价二者之间的相互作用，作者进一步采用ITGB1晶体结构（PDB ID：8W30）进行了分子对接分析。结果显示，在所采用的对接条件下，MNS的预测结合能为−5.42 kcal/mol，而共结晶配体的结合能为−6.53 kcal/mol，提示MNS能够形成一种计算上合理的结合构象。然而，作者同时强调，这一结果仅来源于计算模拟，尚不足以证明MNS能够与ITGB1发生真实的直接结合。 作者指出，ITGB1是介导细胞–细胞外基质黏附以及Integrin–FAK–Src信号通路的重要分子，在多种病毒感染过程中发挥关键作用，可作为病毒直接受体、共受体或宿主辅助因子参与病毒侵入、胞内运输及复制等多个阶段。此外，ITGB1相关信号通路还参与炎症反应调控，并能够促进有利于病毒复制的细胞内环境形成。因此，上述研究结果支持ITGB1可能是MNS发挥宿主靶向抗病毒作用的重要宿主因子，但这一假设仍需进一步实验验证。 为了进一步明确MNS作用于病毒生命周期的具体阶段，作者分别以RNA病毒VSV和DNA病毒HSV-1为代表进行了加药时序（time-of-addition）实验。RT-qPCR检测结果显示，即使MNS分别于病毒感染后0、12或24 h加入培养体系，仍然能够显著抑制病毒RNA水平（图6a，补充图18a），说明MNS主要作用于病毒侵入后的阶段。与此同时，在4 ℃条件下进行的病毒吸附实验发现，MNS预处理并不会显著影响病毒与细胞表面的结合能力（图6b，补充图18b）；进一步在37 ℃同步内吞实验中，作者同样观察到MNS不会抑制病毒进入细胞的过程（图6c，补充图18c）。上述结果共同表明，MNS并非通过阻断病毒吸附或内吞发挥抗病毒作用，而是在病毒进入宿主细胞之后抑制病毒复制，更符合宿主靶向或胞内抗病毒机制的作用特点。 基于上述发现，作者进一步采用VSV感染小鼠模型评价MNS的体内抗病毒及抗炎活性。结果显示，与对照组相比，经MNS（30 mg/kg/day）治疗的野生型C57BL/6小鼠生存率明显提高（图6d）。同时，RT-qPCR检测发现，MNS处理后小鼠肝脏和脾脏中的病毒RNA水平显著下降，血液中的病毒载量也呈下降趋势（图6e）。此外，炎症因子检测结果表明，MNS能够明显减轻病毒感染诱导的炎症反应，在肝脏和脾脏中，Il1β和Il6表达水平均显著降低，而血液中的Tnfα水平也明显下降（补充图19）。 综上所述，作者认为MNS主要通过宿主靶向机制发挥广谱抗病毒作用。研究推测，MNS可能通过调控ITGB1相关信号通路，在病毒侵入宿主细胞后抑制病毒复制，并同时减轻病毒诱导的炎症反应，从而阻断有利于病毒复制的细胞内环境形成，最终在体内发挥良好的抗病毒保护作用。 图6 MNS作用阶段分析支持其通过宿主靶向的病毒侵入后机制发挥作用 （a） 加药时序实验（Time-of-addition assay）。RAW264.7细胞分别感染VSV或HSV-1（37 ℃，1 h）后洗涤，并于感染后0、10、20或40 h加入MNS（20 μM），于病毒感染24 h后采用RT-qPCR检测病毒RNA水平。柱状图表示平均值，误差线表示标准误（s.e.m.），散点表示各独立数据点。（b） 病毒吸附实验。RAW264.7细胞预冷后于4 ℃条件下与VSV或HSV-1共同孵育1 h，随后冰冷PBS洗涤，并采用RT-qPCR定量细胞表面结合的病毒基因组。柱状图表示平均值，误差线表示标准误，散点表示各独立数据点。（c） 病毒内吞实验。细胞于4 ℃完成病毒结合后，经PBS洗涤，再于37 ℃孵育60 min促进病毒内化，随后采用胰蛋白酶消化去除细胞表面未进入细胞的病毒，并采用RT-qPCR检测细胞内病毒RNA水平。图a–c的数据均来源于3次独立生物学重复（n = 3）。除特别说明外，统计学分析采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。ns，P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。（d） VSV腹腔感染小鼠后连续5 d给予MNS（30 mg/kg）治疗的小鼠生存曲线，采用Log-rank（Mantel–Cox）检验进行统计分析。（e） 对照组和MNS治疗组小鼠肝脏、脾脏及血液中VSV RNA水平的RT-qPCR定量分析。柱状图表示平均值，误差线表示标准误，散点表示各独立数据点（n = 6只/组）。统计学分析采用双侧非配对Student's t检验。 END